Tesis doctoral de Rosa María Ferraz Colomina
En los últimos años, los biosensores han representado un gran avance en la detección de moléculas. Están compuestos por un receptor biológico, que puede ser un ácido nucleico, proteína, célula, etc., Y por un transductor de la señal, generalmente electrodos, microbalanzas, componentes ópticos o semiconductores. Entre otros tipos de biosensores, los biosensores proteicos destacan por contener receptor y transductor, puesto que la molécula entera se produce biológicamente. Además, la existencia de técnicas de ingeniería de proteínas hace que se puedan diseñar biosensores a la carta, aptos para detectar específicamente moléculas de interés. los biosensores alostéricos forman parte del grupo de biosensores proteicos y se caracterizan por ser activados o inhibidos por la interacción con el analito. El efecto sobre su actividad es debido a pequeños cambios conformacionales dentro de la proteína derivados de esa interacción. En el presente trabajo se ha caracterizado un biosensor alostérico previamente sintetizado, llamado nf795gpc, para la detección de anticuerpos específicos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (vih) y basado en el uso del enzima beta-galactosidasa de escherichia coli. El determinante antigénico p1 de la proteína gp41 de la envuelta del vih-1 fue insertado en posición 795 de la proteína, alterándose considerablemente la actividad específica del enzima. En presencia de anticuerpos específicos contra el epítopo insertado, el enzima es capaz de aumentar su actividad viéndose claramente un aumento de la cantidad de producto de la reacción. Así, la respuesta del sensor se mide como porcentaje de activación, en el cual se compara el producto obtenido en presencia de anticuerpo con el producto obtenido en ausencia de éste. se empezó caracterizando la proteína nf795gpc, y optimizando las condiciones de la reacción para mejorar la respuesta del sistema. Esto se realizó mediante la obtención de las concentraciones óptimas de proteína y de substrato que daban mayores valores de activación de la proteína y también mediante la selección de los substratos que dieran una mayor sensibilidad al sistema, un mayor rango de respuesta y valores de activación más elevados. la proteina nf795gpc en estado inmovilizado mantenía las propiedades alostéricas previas y además era lo suficientemente estable para poder desarrollar en el futuro un test útil a nivel de campo. también se describió la capacidad del sensor para discernir entre diferentes tipos de anticuerpos presentes en el suero. El análisis de las subpoblaciones de anticuerpos de sueros infectados por vih que reconocían al sensor, resultó en una relación directa entre la activación del sensor y el nivel de inmunoglobulinas tipo igg4.Análisis de sueros de pacientes infectados que no habían seguido un tratamiento antirretroviral revelaron la correlación del nivel de inmunoglobulinas tipo igm con la activación del sensor, sugiriendo cambios funcionales en anticuerpos derivados del tratamiento antirretroviral. finalmente, la construcción de nievas proteínas incluyendo otros fragmentos antigénicos del vih-1, permitió la mejora de la sensibilidad del sistema obtenida previamente, llegando a valores de hasta un 98% en un conjunto de 61 sueros. el desarrollo de un ensayo económico, sencillo y con resultados rápidos en la detección de enfermedades infecciosas basado en enzimas, podría ser de gran ayuda en salud pública, sobretodo en aquellos países donde la falta de recursos impide un diagnóstico rápido y eficaz de las enfermedades.
Datos académicos de la tesis doctoral «Development of allosteric biosensors for the diagnosis of infectious diseases«
- Título de la tesis: Development of allosteric biosensors for the diagnosis of infectious diseases
- Autor: Rosa María Ferraz Colomina
- Universidad: Autónoma de barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 19/06/2008
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Antonio Villaverde Corrales
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Juan Carlos Sáiz calahorra
- jordi xavier Feliu gil (vocal)
- grzegorz Wegrzyn (vocal)
- carles Morte marti (vocal)