Tesis doctoral de Jessica Fioravanti
El interferón fue descubierto hace más de 50 años, como un inhibidor de la replicación del virus influenza. Actualmente la familia de citoquinas de ifn se reconoce como un componente clave en la respuesta sistema inmune innato, y en la primera línea de defensa frente a infecciones virales. La corta vida media del ifnα sin modificar hace necesaria la administración frecuente del fármaco durante largos periodos de tiempo. Por ello se han estudiado varias estrategias para conseguir la estabilización de la proteína, como la unión del ifnα a polietilenglicol, o la fusión génica de la albúmina con el ifnα. a pesar de su eficacia clínica, el tratamiento con ifnα produce efectos secundarios: (i) neuropsiquiátricos, (ii) trombocitopenia, (iii) y leucopenia. Por ello planteamos que la vectorización de ifn al hígado, favorezca su actividad localizada, y disminuya los efectos adversos. se identificó una proteína fisiológica, que no desencadene respuesta inmunológica frente a sí, con una larga vida media, y de localización hepática: las lipoproteínas de alta densidad (hdls) poseen propiedades anti-aterogénicas, debido a que pueden retirar el colesterol de las arterias, y transportarlo de vuelta al hígado para su excreción. Dichos efectos son principalmente debidos a la apolipoproteína a-i (apoa-i), proteína mayoritaria de la partícula de hdl. La apo a-i es una proteína de bajo peso molecular, que una vez libre en plasma mayoritariamente se acompleja formando hdls, mientras que sólo el 3.7%-8.1% restante circula en la forma libre. La vida media de la apo a-i es de 15 – 54 h. Se ha demostrado además que tras la administración sistémica de apo a-i, ésta se biolocaliza en el hígado. se clonaron los genes del ifnα de ratón seguido del gen de la apo a-i murina. Este plásmido codifica para una proteína de fusión que a partir de ahora denominamos interapo (ia). La administración de esta proteína quimérica, tanto por vía de terapia génica, como por inyección intravenosa de la proteína recombinante, demostró un aumento de la vida media del ifnα de 2.6 a 5 veces. otro aspecto fundamental estudiado fue la biodistribución. Tras 150 min. De tratamiento con 1µg de rifn o ria hemos demostrado que podemos detectar por elisa la presencia de ria mayoritariamente en hígado, y trazas también a nivel pulmonar y de bazo, mientras que a ese tiempo no es posible detectar rifn en ningún órgano. La actividad de los interferones de tipo i está mediada por proteínas codificadas por genes inducibles por interferón (isgs). Para comprobar si la construcción quimérica mantenía dicha capacidad, se analizó los niveles de arnm de 2¿-5¿ oas, usp18, e isg15 tres días tras la inyección hidrodinámica o 24 h tras la inyección intravenosa de las proteínas recombinantes. Las construcciones quiméricas aumentan los niveles de arnm de los isgs estudiados en hígado, indicando la dianización al hígado de la construcción. hemos aislado el gen de la apo a-i de marmota. Esto ha permitido generar la proteina interapo de marmota monax, único animal que sufre una hepatitis viral comparable a la de hbv humano. Esta proteína de fusión se introdujo en un vector viral adenoasociado, que se inyectó vía intrahepática a una marmota infectada con whv, que a diferencia con las marmotas control tratadas con aav-ifn, continúa viva, y sin síntomas de toxicidad hematológica derivadas del tratamiento crónico con ifn, tras más de 13 meses post-laparotomía. esta disminución de toxicidad se observa también en ratones balb/c y c57/bl6, tras el tratamiento con altas dosis de ia no presentan leucopenia, y la trombocitopenia es significativamente mayor en el grupo que recibe ifn. además los animales tratados con esta formulación, son capaces de generar una lisis específica frente a epítopos específicos de antígeno mediada por linfocitos t citotóxicos (ctls) muy superior a la conseguida con el tratamiento de ifn.
Datos académicos de la tesis doctoral «Engineering apolipoprotein a-i as a molecular scaffold: generation of interapo«
- Título de la tesis: Engineering apolipoprotein a-i as a molecular scaffold: generation of interapo
- Autor: Jessica Fioravanti
- Universidad: Navarra
- Fecha de lectura de la tesis: 01/07/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Pedro Berraondo López
- Tribunal
- Presidente del tribunal: raul Jesús Andrade bellido
- Javier Garcia-samaniego rey (vocal)
- gloria Gonzales aseguinolaza (vocal)
- jean-michel Pawlotsky (vocal)