Tesis doctoral de Elena Gonzalez Muñoz
El tejido adiposo blanco tiene un papel clave en el metabolismo, ya que además de ser el principal reservorio de triacilglicéridos, actúa como órgano endocrino secretando a la circulación diferentes moléculas, las llamadas adipoquinas, implicadas en mecanismos de señalización y en la sensibilidad periférica a la insulina. En este sentido el tejido adiposo es muy importante en el mantenimiento de la homeostasis energética regulando la secreción de insulina, la acción de la insulina y el metabolismo glucídico y lipídico (mora et al., 2002). los adipositos son el tipo celular con mayor concentración de caveolas en la superficie de su membrana plasmática. Observaciones realizadas por microscopia electrónica demuestran que las caveolas representan un 30% de la superficie de la membrana de los adipositos (fan et al., 1983). Como se ha explicado en la introducción, las caveolas son dominios especializados de la membrana plasmática, son un subtipo de raft lipídico, enriquecidos en esfingolípidos y colesterol y caracterizados por la presencia de caveolina, que es la principal proteína de la cubierta caveolar (rothberg et al., 1992; anderson, 1998; kurzchalia et al., 1999). la función de las caveolas y de la caveolina in vivo ha sido motivo de controversia, de hecho se han implicado en procesos de endocitosis y transcitosis, transporte de colesterol y ácidos grasos, regulación de procesos de transducción de señales y tumorigénesis (liu et al., 2002 a). a partir de estos antecedentes, el objetivo general de esta tesis ha sido: definir la función de las caveolas/caveolina-1 en la fisiología del adipocito. en el momento de iniciar la tesis, en nuestro laboratorio se estaban usando algunos tratamientos que unen y/o extraen el colesterol de las membranas y que está descrito que alteran la estructura de los rafts lipídicos/caveolas (rothberg et al., 1992 schnitzer et al., 1994; orlando et al., 1998). nos planteamos así nuestro primer objetivo: 1. Comprobar que los tratamientos que unen o extraen colesterol de las membranas (nistatina, filipina, beta ciclodextrina y metil-beta-ciclodextrina) alteran la estructura de los rafts lipídicos/caveolas de adipositos 3t3l1, y analizar el efecto que tienen estos tratamientos sobre la acción de la insulina estimulando el transporte de glucosa y sobre la activación de la via de señalización de la insulina cbl/tc10 asociada a caveolas. Además, estudiamos otras acciones de la insulina que pudieran depender de la vía de señalización cbl/tc10, analizando el efecto de los tratamientos sobre la acción de la insulina activando la lipogénesis o inhibiendo la lipólisis en adipositos 3t3l1 los tratamientos usados en el objetivo l unen o extraen el colesterol de las membranas y pueden provocar cambios severos en los rafts lipídicos (no específicamente en caveolas) y en la membrana plasmática en general. nos planteamos, por tanto, alterar específicamente las caveolas de los adipositos 3t3l1 disminuyendo la expresión de caveolina-1 en sus membranas. Así, nuestros siguientes objetivos fueron: 2- obtención de líneas 3t3l1 deficientes en caveolina-1 mediante silenciamiento génico postranscripcional. una vez conseguidos estos adipositos 3t3l1 deficientes en caveolina-1 nos planteamos: 3.- Analizar la presencia de caveolas y la distribución de la caveolina-1 remanente en las membranas de los adipositos y estudiar la estructura y composición de los rafts lipídicos/caveolas en estos adipositos deficientes en caveolina-1 una vez analizado el efecto que tiene la carencia de caveolina-1 sobre los rafts lipídicos, quisimos estudiar si esta deficiencia afectaba funcionalmente a los adipositos. Así nos planteamos: 4.-Analizar la diferenciación adipocitaria de los preadipocitos 3t3l1 deficientes en caveolina-1. Estudiando tanto sus características morfológicas y contenido lipídico, como la expresión de marcadores proteícos característicos de adipositos maduros. está descrita la importancia de las caveolas/rafts lipídicos en la señalización de insulina estimulando el transporte de glucosa en adipositos (baumann et al., 2000; pessin and saltiel, 2000; omata et al., 2000; chiang et al., 2001; kanzaki and pessin, 2001 a). Por un lado, se ha descrito que para esta acción de la insulina es indispensable la activación de dos vías de señalización: una dependiente de la quinasa pi3k, y otra independiente, asociada a caveolas que se denomina cbl/tc10. Por otro lado, se había descrito la localización del receptor de insulina (ir) en caveolas/rafts lipídicos (gustavsson et al., 1999; vainio et al., 2002) y la interacción de ir con caveolina-1 (couet et al., 1997 a; yamamoto et al., 1998; nystrom et at., 1999). Así como sexto objetivo quisimos. 5.- Analizar la acción de la insulina en los adipositos deficientes en caveolina-1, estudiando, por un lado, tanto la activación de las rutas de señalización de la insulina como la estimulación que provoca en la translocación del transportador de glucosa glut4 a la membrana plasmática y en el transporte de glucosa. Por otro lado también estudiamos la implicación de la caveolina-1 en otros acciones metabólicas de la insulina en los adipositos como son la inhibición de la lipólisis y la estimulación de la lipogénesis. existen diversas evidencias descritas en la bibliografía que relacionan caveolas y caveolina-1 con la homeostasis lipídica y obesidad a partir del fenotipo de los ratones ko de caveolina-1 (rasan et al., 2002 a; brasaemle et al.,2004; cohen et al., 2004 a). Así , se ha relacionado a caveolina-1 en la formación de los lds (cohen et al., 2004b), también modulando la lipólisis activada por efectores beta-adrenérgicos (brasaemle et al., 2004; rasan et al., 1999; cohen et al., 2004b), en el balance y tráfico de colesterol y lípidos neutros en los adipositos (pol et al., 2004; pol et al., 2005; martín et al., 2005) y en el transporte de ácidos grasos a través de la membrana plasmática ( pohl et al.,2002; pohl et al.,2004b; pohl et al., 2005; ring et al., 2006). Teniendo en cuenta estos antecedentes, nuestro último objetivo fue: 6.- Estudiar el papel de caveolina-1 en el metabolismo lipídico del adipocito, analizando tanto el transporte de ácidos grasos de cadena larga a través de la membrana plasmática, como la movilización de los triglicéridos almacenados ante estímulos lipolíticos. a partir de los objetivos planteados conseguimos obtener las siguientes conclusiones en el desarrollo de esta tesis: 1.-Los tratamientos metil-beta-ciclodextrina y ciclodextrina, que extraen el colesterol de las membranas, alterando la estructura y composición de las caveolas/rafts lipídicos. Disminuyen el efecto de la insulina estimulando el transporte de glucosa en adipositos 3t3l1. Esta disminución se debe al aumento que provocan sobre el transporte de glucosa basal. Sólo el tratamiento con metil-beta-ciclodextrina afecta la vía de señalización de la insulina que lleva ala estimulación del transporte de glucosa, disminuyendo la fosforilación de c-cbl y akt un 50%. los tratamientos metil-beta-ciclodextrina y ciclodextrina, afectan a la lipólisis y la lipogénesis de los adipositos 3t3l1 de manera independiente al efecto que puedan tener sobre la señalización de la insulina inhibiendo o estimulando, respectivamente, estas rutas metabólicas. 2.- Por primera vez en nuestro laboratorio se han generado partículas lentivirales que permiten la expresión de transgenes y de moléculas de sirna. se ha conseguido la transducción eficiente de adipositos 3tl1 maduros usando estas partículas lentivirales que expresan transgenes, aunque no se ha logrado transducir los adipositos maduros eficazmente en el caso de los lentivirus que expresan moléculas de sirna. los preadipocitos 3t3l1 son eficientemente transducidos usando las partículas lentivirales que permiten la expresión tanto de transgenes como de moléculas de sirna. Mediante esta técnica hemos generado líneas estables 3t3l1 que expresan moléculas de sirna de caveolina-1 y que presentan una reducción en la expresión de la proteína caveolina-1 de más del 93%. 3.- La disminución de la proteína caveolina-1 en más de un 93% en adipositos 3t3l1 provoca una disminución equivalente en el número de caveolas en la membrana plasmática. 4.- La diferencia en caveolina-1 en los adipositos 3t3l1 no afecta a la localización de los marcadores proteícos y lipídicos característicos de los rafts lipídicos, que continúan recuperándose en las fracciones ligeras de los extractos celulares durante el aislamiento bioquímica de los rafts lipídicos. 5.- La deficiencia en caveolina-1 y caveolas no afecta a la diferenciación de los preadipocitos 3t3l1 a adipositos maduros, ni tampoco a las características morfológicas y el contenido lipídico /triacilglicéridos y colesterol) de los adipositos maduros. 6.- Los adipositos 3t3l1 con una disminución del 93% en la expresión de caveolina-1, presentan una reducción del 50% en la expresión de las proteínas glut4 y del 40% en el caso del receptor de insulina, sin que este hecho responda a una menor cantidad de sus rna mensajeros, sino a una disminución en la vida media de estas proteínas. Este dato sugiere que caveolina-1 participe en la estabilidad de estas proteínas. 7.- El déficit de caveolina-1 en los adipositos 3t3l1 no afecta a las vías de señalización de la insulina (dependiente de pi3k y dependiente de cbl-tc10) ni tampoco a la translocación de glut4 a la membrana plasmática inducida por la insulina ni a la estimulación del transporte de glucosa. 8.- La presencia de caveolas/caveolina-1 no es necesaria para la correcta internalización de glut4 durante la reversión de la acción de la insulina. 9.- Las caveolas/caveolina-1 tampoco son necesarias para la acción de la insulina inhibiendo o activando la lipólisis y la lipogénesis en los adipositos 3t3l1, respectivamente. 10.- La deficiencia de caveolina-1 y caveolas no altera el transporte de ácido palmítico a través de la membrana plasmática de adipositos 3t3l1. esta deficiencia tampoco altera la activación lipolítica por los efectores beta-adrenérgicos: isoproterenol 10mm e ibmx 0,5 mm en los adipositos 3t3l1.
Datos académicos de la tesis doctoral «Papel de las caveolas/caveolina-1 en la fisiología del adipocito«
- Título de la tesis: Papel de las caveolas/caveolina-1 en la fisiología del adipocito
- Autor: Elena Gonzalez Muñoz
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 28/11/2007
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Marta Campos Camprubi
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Marta Giralt oms
- josep antoni Villena delgado (vocal)
- albert Pol sorolla (vocal)
- María del carmen Carmona orozco (vocal)