Tesis doctoral de Mónica Carrera Mouriño
La gran cantidad de información disponible en las bases de daos biológicas, junto con los rápidos avances logrados en el campo de la proteómica, están permitiendo la identificación, caracterización y cuantificación sistemática de un gran número de proteínas. Peso a estos avances, el genoma de muchos organismos todavía es desconocido o está escasamente secuenciado, y en consecuencia, para muchos de ellos, el número de registros proteicos disponibles en las bases de datos es ínfimo. Tal es el caso particular de la amplia mayoría de organismos marinos, y más en concreto de las especies de merluza, todas ellas pertenecientes a la familia merlucciidae, -teleosteos con importantes connotaciones comerciales-, cuyo estudio es objeto de esta tesis. en esta memoria se aplican las diferentes estrategias proteómicas, tanto bottom-up como top-down, al estudio y caracterización de varias fracciones de proteínas específicas de las distintas especies que conforman la familia merlucciidae. Básicamente y mediante una estrategia bottom-up, el análisis y comparación de las proteínas sarcoplásmicas del músculo blanco de las distintas especies mediante ekectroforesis bidimensional, permitió la detección de dos regiones potencialmente diferenciadoras. La primera de ellas correspondió al grupo o fracción de las nucleósido difosfato quinasas (ndk) y la segunda, al grupo que componen las distintas isoformas de parvalbúminas (prvb). Las diferencias en su movilidad electroforética, indicativas de la presencia de variaciones aminoacídicas en sus secuencias, justificaron su posterior caracterización mediantes espectrometría de masas (ms). La segunda fase de la estrategia bottom-up, consistió en la caracterización diferencial de los digeridos enzimáticos de dichos spots mediante ms maldi-tof o mediante ms en tándem (ms/ms), utilizando para ello un equipo esi-it. El análisis de los resultados puso de manifiesto la escasa representación en la bases de datos de las proteínas pertenecientes a la familia merlucciidae, por lo que la inmensa mayoría de los espectros de fragmentación, tuvieron que ser analizados empleando distintos procedimientos de secuenciación de novo. De tal forma que, mediante la interpretación directa y manual de sus correspondientes espectros de fragmentación, asistida por los resultados obtenidos mediante los programas de secuenciación de novo automáticos peaks y denovox y fundamentalmente mediante el prototipo en desarrollo de parseq 4, así como la interpretación manual asistida por el marcaje isotópico estable con 18o, se logró la identificación y secuenciación de novo de un total de 13 isoformas distintas de las ndk y 42 isoformas distintas de las prvb, de las cuales 26 isoformas de prvb fueron secuenciadas completamente. asimismo, la comparación de las secuencias obtenidas para las distintas ndk y prvb permitió la identificación de un conjunto de péptidos comunes y de otros diferenciales, que fueron considerados como péptidos biomarcadores. Estos péptidos fueron utilizados mediante un novedoso desarrollo metodológico basado en su monitorización mediante ms, que logra la identificación de las distintas especies comerciales de la familia merlucciidae, de la menra más rápida (<2h) y eficiente disponible hasta el momento. Con este nuevo procedimiento, se consigue la identificación de la especie, o de mezclas de especies en cualquier producto o subproducto fresco, refrigerado, congelado, elaborado o precocinado, obtenido a partir de especies pertenecientes a la familia merlucciidae. finalmente, por medio de una estrategia top-down utilizando un espectrómetro de masas de alta resolución (fticr), se llevó a cabo el análisis y caracterización de la fracción de prvb, esta vez sin digerir. Esta estrategia permitió por un lado el plantemiento de un nuevo procedimiento de identificación, en base a la determinación precisa de las m, del conjunto de isoformas de prvb para cada especie y por el otro, la confirmación de los resultados obtenidos de la secuenciación de novo completa de las prvb mediante la estrategia bottom-up.
Datos académicos de la tesis doctoral «Proteómica bottom-up y top-down de organismos poco secuenciados. secuenciación de novo de péptidos biomarcadores para la identificación de especies de la familia merlucciidae«
- Título de la tesis: Proteómica bottom-up y top-down de organismos poco secuenciados. secuenciación de novo de péptidos biomarcadores para la identificación de especies de la familia merlucciidae
- Autor: Mónica Carrera Mouriño
- Universidad: Vigo
- Fecha de lectura de la tesis: 11/03/2008
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- José Manuel Gallardo Abuin
- Tribunal
- Presidente del tribunal: laura Sánchez piñón
- concepcion Gil garcia (vocal)
- Jesús Vazquez cobos (vocal)
- Jorge Barros velázquez (vocal)