Tesis doctoral de Concepción García Montañés
La división celular en e. Coli implica el ensamblaje de un complejo macromolecular, denominado divisoma, formado por varias proteínas, 10 de ellas esenciales. Se conoce la secuencia lineal y concertada de ensamblaje que siguen estas proteínas del divisoma y algunas de sus actividades bioquímicas, así como algunas interacciones proteína-proteína involucradas. Inicialmente, 3 proteínas, ftsz, zipa y ftsa ensamblan juntas formando el proto-anillo en el cual se van incorporando el resto de componentes. El anillo-z es altamente dinámico y su posición se regula por 2 sistemas de control negativo que inhiben la formación del anillo en posiciones erróneas. El complejo inicial recluta más tarde el resto de proteínas de división, siendo todas ellas proteínas de membrana. En la presente tesis se ha usado un sistema de membrana in vitro, llamado nanodiscos, para estudiar 2 proteínas de división de membrana, zipa y ftsn. Zipa es una proteína de 36.4 kda con una única hélice transmembrana seguida de un largo dominio desestructurado flexible y un pequeño dominio c-terminal que une ftsz en el citoplasma. Ftsn, en cambio, presenta una topología inversa, con un pequeño n-terminal desestructurado y cargado en el citoplasma seguido de un dominio transmembrana, un dominio grande y flexible y un pequeño dominio spor en la cara periplásmica que interacciona con peptidoglicano. Ambas proteínas se incorporaron en nanodiscos, un modelo de membrana que consiste en un parche de lípidos con forma de disco formando una bicapa rodeado por 2 copias de la proteína msp (membrane scaffold protein), análoga de la proteína apoa-1, la cual estabiliza la membrana. Estas estructuras son solubles, monodispersas y tienen un diámetro de unos 10 nm. Los nanodiscos proporcionan un entorno topológicamente restringido a las proteínas de membrana mientras las mantiene en solución, permitiendo el uso de un gran número de de herramientas bioquímicas y biofísicas para caracterizar cuantitativamente las proteínas insertadas en ellos y sus interacciones. El objetivo general de esta tesis fue poner a punto el sistema de nanodiscos como soporte para el estudio de interacciones entre proteínas del divisoma de e. Coli. Este trabajo es pionero en españa, tanto en el uso del sistema de nanodiscos para insertar proteínas de membrana, como en la aplicación de este sistema para medir interacciones entre proteínas de forma cuantitativa.La primera parte de la tesis describe la caracterización hidrodinámica de los nanodiscos mediante ultracentrifugación analítica (auc) y dispersión de luz dinámica (dls), con el objetivo de establecer una referencia para experimentos más complejos que incluyan proteínas de membrana en nanodiscos.La segunda parte, describe la incorporación de la proteína completa zipa en nanodiscos y su caracterización biofísica mediante auc, dls y espectroscopía de correlación de fluorescencia (fcs), además de la caracterización mediante microscopía electrónica de transmisión (tem). Además, se estudió la interacción de los nanodiscos de zipa con ftsz, tanto en su forma oligomérica gdp, como en su forma polimérica gtp mediante auc y fcs; los complejos ftsz/nanodiscos se visualizaron mediante tem.Finalmente, la tercera parte describe la purificación, caracterización e incorporación de ftsn en nanodiscos, usando las mismas técnicas que las descritas para zipa.
Datos académicos de la tesis doctoral «Reconstitución funcional de elementos del divisoma bacteriano en nanoddiscos.«
- Título de la tesis: Reconstitución funcional de elementos del divisoma bacteriano en nanoddiscos.
- Autor: Concepción García Montañés
- Universidad: Complutense de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 27/04/2014
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Víctor Manuel Hernández Rocamora
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Jesús Perez gil
- Manuel Prieto (vocal)
- María dolores Pérez-sala gozalo (vocal)
- Jesús Mingorance cruz (vocal)