Tesis doctoral de Alejandra Garcia Ruiz
Los nematodos endoparásitos sedentarios de plantas producen importantes pérdidas económicas en la agricultura. Entre ellos destaca el género meloidogyne, que afecta a una amplia variedad de cultivos y está ampliamente distribuido por todo el mundo. Estos nematodos seleccionan varias células del cilindro vascular de la raíz (4-8) y las modifican de modo que experimentan sucesivas mitosis con citocinesis incompletas, originándose varias células multinucleadas de gran tamaño denominadas células gigantes (cgs). Estas poseen numerosas invaginaciones de la pared celular adyacente al xilema, un citoplasma denso con un retículo endoplasmático muy desarrollado, y gran cantidad de orgánulos como mitocondrias, ribosomas y pro-plastidios. Los importantes cambios metabólicos y fisiológicos necesarios para poder formar estas células especializadas transcurren a través de un importante proceso de reprogramación génica de las células precursoras. El inicio del proceso de diferenciación de estas cgs parece que viene marcado por moléculas efectoras secretadas por el nematodo a las células precursoras mediante el estilete, pero los mecanismos moleculares implicados en la formación de estas estructuras celulares al servicio de la nutrición del nematodo, denominadas sitios de alimentación (nematode feeding sites, nfss) son aún desconocidos en gran medida. debido a que los medios de control de nematodos químicos y físicos más utilizados en agricultura no son totalmente efectivos, o están prohibidos o en fase de prohibición en la unión europea, el control mediante herramientas biotecnológicas basadas en plantas resistentes o tolerantes a nematodos se plantea como una opción necesaria. Una de estas estrategias pretende interferir directamente con el desarrollo de los nematodos, o con la formación de los sitios de alimentación, bien mediante la expresión de proteínas citotóxicas, o mediante el bloqueo de genes esenciales para el desarrollo de los mismos. En cualquier caso, la expresión del transgén debería estar lo más restringida posible a los sitios de alimentación. Para ello, se requiere el estudio pormenorizado de las regiones reguladoras de los genes (promotores), mediante el análisis de la activación de estos promotores en los nfss y su posible disección y ulterior modificación, con el objetivo de aumentar su especificidad. por este motivo, uno de los principales objetivos de esta tesis doctoral ha sido la identificación de promotores que se induzcan de forma específica en los sitios de alimentación y que presenten un patrón de expresión lo más limitado posible en el resto de los tejidos de la planta y a lo largo de su desarrollo, de forma que pudieran ser utilizados mediante estrategias biotecnológicas para el control de nematodos. Por ello, hemos analizado por una parte promotores de ii genes de la planta y por otra, de genes ajenos a esta, que podrían tener un patrón de expresión algo más restringido. se ha completado el estudio del promotor del gen de choque térmico hahsp17.7g4. En plantas transgénicas de tabaco, se había identificado una región mínima de 83pb que era suficiente para conferir actividad del promotor específicamente en cgs inducidas por m. Javanica y que mantenía su actividad en respuesta a choque térmico y durante embriogénesis cigótica. En este trabajo hemos comprobado que esta versión corta del promotor de choque térmico (-83 hahsp17.7g4) mantiene su actividad en cgs de arabidopsis, así como después de choque térmico, pero no en embriogénesis tardía. Adicionalmente, mediante el análisis de la inducción del promotor g4 tras la infección con globodera tabacum pudimos concluir que el promotor se induce específicamente por nematodos formadores de agallas, pero no de quistes. Se ha podido, por tanto, comprobar que la inducción de una versión mínima del promotor que contiene un elemento hse (heat-shock element) de respuesta a nematodos de forma muy específica en cgs se conserva en diferentes especies de plantas, lo que podría resultar de gran utilidad para una posible aplicación biotecnológica, aunque restringida a los nematodos formadores de agallas. además, los estudios con otros promotores de genes relacionados con la respuesta a embriogénesis tardía y choque térmico que codifican proteínas homólogas a las codificadas por el gen g4 sugieren que la respuesta a choque térmico está más asociada a la activación frente a nematodos que la de embriogénesis tardía. Por un lado, el promotor hahsp17.6g1 (g1), que no responde a choque térmico pero sí en embriogénesis tardía, no se indujo en cgs, mientras que el promotor hahsp18.6g2 (g2), que si se induce por choque térmico, se activó específicamente en cgs. Además, una versión mutada del promotor hahsp17.7g4 (g4mutp) que presenta alta actividad tras choque térmico, pero que tiene afectada su actividad en embriogénesis tardía, se activó en cgs. Las respuestas de los diferentes promotores se correlacionaron con diferentes configuraciones de hses, que podrían estar implicados en la activación en cgs, probablemente a través de factores de transcripción del tipo hsf (heat shock factor). Estos resultados, junto con la comprobación mediante inmunolocalización de que las proteínas de choque térmico de bajo peso molecular (small heat-shock proteins, shsps) de clase i se acumulan en el interior de cgs de tabaco, apoyan la idea de que las cgs inducidas por el nematodo representan un estado transcripcional muy similar al que se produce por choque térmico en lo que se refiere a este tipo de genes, y sugieren que las shsp podrían tener un papel relevante en la formación o mantenimiento de las cgs. también hemos analizado la activación de promotores en sentido del virión del virus del estriado del maíz (maize streak virus, msv) y del virus del enanismo iii del trigo (wheat dwarf virus, wdv). Mediante el análisis de diferentes líneas transgénicas de tabaco y arabidosis que llevaban una fusión de estos promotores a la región codificante de la íY-glucuronidasa (gus), se observó que el promotor msv era activado en tejido vascular aéreo, fundamentalmente en floema de hoja, cotiledón y algunas estructuras florales. Sin embargo, en raíz, la activación del promotor se restringió a sincitios y a cgs, siendo esta indetectable en el resto de tejidos de la raíz. Con estos resultados podemos concluir que el promotor de msv es específico de nfss en la raíz, ya que no se detecta expresión en ningún otro tejido de este órgano. Además, esta conducta se ha observado en dos especies (tabaco y arabidopsis), así como con los dos tipos de nematodos fitoendoparásitos más extendidos (formadores de quistes y agallas), lo que supone una importante ventaja, ya que podría utilizarse como herramienta común para ambos tipos de nematodos y para diferentes especies de plantas. Este estudio sugiere además que puede existir una cierta similitud entre el o los mecanismos de activación del ciclo celular de novo en las células de la planta mediado por geminivirus con el observado en cgs. para poder llevar a cabo esta estrategia biotecnológica anti-sitios de alimentación, además de conseguir un promotor específico, también es necesario identificar genes esenciales para el desarrollo y/o mantenimiento de los nfss, principalmente en los primeros estadios de su desarrollo, de forma que podamos obtener una batería de genes candidatos que puedan ser utilizados junto a los promotores específicos para bloquear el desarrollo de los nfss. para ello analizamos los cambios globales de expresión génica que se producen durante la diferenciación de las cgs mediante un estudio del transcriptoma de cgs en estadios tempranos de formación (3 días) frente a tejido vascular control en arabidopsis. Utilizamos de manera combinada la hibridación de microordenamientos de adn junto con la microdisección de gcs por laser. Gracias a esta combinación técnica, se han podido identificar 1161 genes diferencialmente expresados en cgs, de los que 851 mostraron menores niveles transcripcionales que el control, lo que indica que posiblemente ocurran mecanismos de represión génica en estadios tempranos del desarrollo de cgs que permitan su diferenciación en un tipo celular único. Mi principal contribución a este trabajo ha sido la hibridación en microordenamientos de adn, arn aislado de agallas diseccionadas a mano 3 días post-infección, frente a segmentos equivalentes de raíces control en el mismo estadio de crecimiento, gracias a lo que se pudo realizar la comparación del transcriptoma diferencial de cgs microdiseccionadas por láser con el de agallas diseccionadas a mano. De los 547 genes diferencialmente expresados en agallas frente a los segmentos de raíz control, solo 120 coinciden con los identificados en el transcriptoma diferencial de cgs, lo que confirma la dilución de los tránscritos de cgs en muestras de arn de agallas. La clasificación de los genes exclusivos de cgs (que no se encuentran iv diferencialmente expresados en agallas) y genes distintivos de agallas (que no están diferencialmente expresados en cgs) en categorías funcionales nos ha permitido identificar procesos característicos de cgs, lo que indica la identidad molecular particular de estas células en relación a sus patrones de expresión génica en comparación con el resto de tejidos de la agalla. En general, los genes relativos a la modificación de pared son co-regulados en cgs y agallas. Por el contrario, genes relacionados con el metabolismo secundario, como los implicados en defensa o en síntesis de ligninas son reprimidos en cgs e inducidos en agallas. Un dato de alto interés es que solo 8 de los 100 genes diferencialmente expresados en cgs que codifican factores de transcripción se regulan de modo similar en agallas, lo que sugiere que las cascadas de transducción de señales que llevan a la formación de las gcs y del resto de los tejidos hipertrofiados de las agallas, son muy diferentes. por último, hemos identificado un grupo de genes exclusivos de cgs en sus primeras etapas de desarrollo. Estos genes regulados de modo característico, junto con promotores génicos específicos del sitio de alimentación, podrían ser utilizados en estrategias biotecnológicas, expresándolos o reprimiéndolos en las células gigantes en plantas de interés agrícola para interferir en la formación de los nfss. Estudios posteriores confirmarán su posible eficacia en este control.
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudio de la regulacion de genes en celulas de alimentacion de nematodos endoparasitos sedentarios para su futuro empleo como herramientas biotecnologicas de control«
- Título de la tesis: Estudio de la regulacion de genes en celulas de alimentacion de nematodos endoparasitos sedentarios para su futuro empleo como herramientas biotecnologicas de control
- Autor: Alejandra Garcia Ruiz
- Universidad: Castilla-la mancha
- Fecha de lectura de la tesis: 28/07/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Carolina Escobar Lucas
- Tribunal
- Presidente del tribunal: alfonso g. Navas sanchez
- pilar Cubas dominguez (vocal)
- gregorio Hueros soto (vocal)
- montaña Mena marugan (vocal)