Tesis doctoral de María Dolores Delgado Delgado
El trabajo que se presenta en esta tesis pretende ahondar en el conocimiento de los circuitos génicos que controlan la diferenciación de los estomas en a. Thaliana. Nuestra hipótesis de partida es que el desarrollo de estomas y el correcto establecimiento de su patrón de espaciamiento están asegurados por una red de rutas de desarrollo solapantes y redundantes en las que participan numerosos genes y que se imbrican con las respuestas a los factores ambientales. Puesto que el número de estomas y su distribución en la hoja son determinantes para la supervivencia de cada individuo a su ambiente particular, es de esperar que ambos caracteres hayan estado sometidos a una fuerte presión selectiva que daría como resultado una amplia variabilidad natural, si bien enmarcada en límites bastante estrechos en los que no se incluyen fenotipos extremos o aberrantes y que incorporaría las respuestas adaptativas a combinaciones concretas de factores ambientales. En a. Thaliana, mucha de esta variabilidad natural es accesible, como lo son las herramientas moleculares para progresar hasta la identificación molecular de los determinantes genéticos que contribuyen a un carácter cuantitativo dado y el estudio de sus funciones e interrelaciones (koornneef y col., 2004; alonso-blanco y col., 2009). En el caso del desarrollo de estomas, su análisis cuantitativo es posible a través de parámetros directamente relacionados con el proceso y medibles experimentalmente, como el índice y la densidad estomática. El modelo actual del desarrollo de estomas en a. Thaliana está basado en el estudio de mutaciones inducidas que producen fenotipos aberrantes y, a menudo, no viables. Sin embargo, el trabajo recogido en esta tesis acomete por primera vez la identificación de determinantes genéticos que modulan la abundancia de estomas mediante el análisis de la variación natural entre accesiones de a. Thaliana. Hasta la fecha solamente se ha descrito variación en la densidad de estomas en un número limitado de accesiones de a. Thaliana en presencia de elevadas concentraciones de co2 (woodward y col., 2002). Sin embargo, aún no hay disponible ningún registro detallado de la variación natural entre accesiones para caracteres relacionados con la abundancia de estomas en esta especie modelo. La identificación de genes a través de sus alelos naturales aporta información esencial sobre los tipos de mutación, mecanismos moleculares y circuitos génicos implicados en la microevolución y adaptación de las plantas a los cambios ambientales (revisado por alonso-blanco y col., 2009). Por ello, desvelar la arquitectura genética de la abundancia de estomas e identificar sus reguladores es además relevante para sustentar la modificación inteligente del compromiso entre fotosíntesis y transpiración en especies cultivadas para mejorar su productividad. en la primera parte del trabajo (capítulo 2) se explora la variación natural en la abundancia de estomas en a. Thaliana. Para ello se analizan un total de 62 accesiones silvestres agrupadas en dos colecciones independientes. El estudio incluye una cuantificación detallada y sistemática de caracteres relacionados con la abundancia celular (densidades celulares de estomas y de células de pavimento- e índice estomático) en las superficies epidérmicas adaxiales de cotiledones y primeras hojas, junto con un análisis de correlación entre los distintos caracteres para establecer las posibles relaciones que se establecen entre ellos en un mismo órgano así como para contrastar la existencia de una regulación coordinada de abundancia de estomas en cotiledones y hojas. Además, en una de las dos colecciones también se analiza la variación del tamaño de los órganos y su relación con los mecanismos que controlan la iniciación de linajes y su proliferación. Por otra parte, se evalúa la contribución de los efectos ambientales maternos (derivados de las condiciones de laboratorio en las que se desarrollaron las plantas madres) sobre el conjunto de los caracteres estudiados. Por último, se examina si las accesiones naturales difieren en la contribución que distintos procesos de desarrollo tienen sobre el índice estomático del órgano maduro, mediante el análisis de dos parámetros cuantitativos: la proporción de linajes primarios derivados de células protodérmicas, y la proporción de linajes satélite originados tras la adquisición de identidad de célula madre de meristemoide por las células no estomáticas de los linajes primarios. los resultados obtenidos desvelan que en a. Thaliana existe una amplia variación genética natural para todos los caracteres relacionados con la abundancia de estomas medidos, siendo la densidad de estomas el carácter con mayor rango de variación y el índice estomático el que mostró la menor variación. La densidad de células del pavimento, relacionada con el tamaño celular, muestra una variación moderada. Además, nuestro estudio revela que las diferencias en los ambientes maternos usados en nuestro estudio no afectan, o lo hacen marginalmente, a los caracteres relacionados con la abundancia celular en cotiledones y primeras hojas, y por lo tanto indican que las diferencias fenotípicas encontradas entre accesiones en los caracteres celulares están determinadas principalmente por variaciones genéticas y no por el ambiente materno utilizado. el análisis de las correlaciones entre los caracteres estomáticos revela una serie de relaciones generales entre los parámetros estudiados. En un mismo órgano, la densidad estomática correlaciona fuertemente con el resto de los caracteres medidos, lo que sugiere la existencia de bases genéticas comunes, consistentes con el mecanismo propuesto que coordinaría proliferación y expansión celular a nivel de órgano (tsukaya, 2006; fujikura y col., 2007; fujikura y col., 2009; tsukaya, 2008; micol, 2009). Así mismo, se ha encontrado correlación de un mismo carácter entre órganos, lo que sugiere un mecanismo supra-órgano para la coordinación de la abundancia de estomas en a. Thaliana. No obstante, el análisis de agrupamiento realizado con las distintas accesiones en función de sus patrones fenotípicos, revela también la existencia de fenotipos poco frecuentes que escapan a estas relaciones generales y evidencian diferencias entre los programas genéticos que controlan varios de los caracteres. También se ha encontrado variación en el tamaño del cotiledón y la primera hoja, que a su vez correlaciona negativamente con las densidades celulares en los dos órganos y con el índice estomático en los cotiledones; en términos generales, estos resultados muestran que las accesiones naturales cumplen con las teorías mencionadas anteriormente de coordinación en el comportamiento celular durante el crecimiento de la hoja (revisado por tsukaya, 2008), y sugieren que, al menos en los cotiledones, el desarrollo de los linajes estomáticos está parcialmente ligado a un control del crecimiento que actúa a nivel de órgano. finalmente, este estudio identifica variación natural en la proporción relativa entre los linajes primarios y satélites en las accesiones analizadas, indicando que la diversidad natural en la abundancia de estomas resulta de la distinta contribución de diferentes procesos durante el desarrollo de los estomas: accesiones con índices estomáticos similares muestran diferentes proporciones de linajes primarios y satélites, revelando fenotipos de desarrollo ocultos bajo un mismo carácter de abundancia estomática y mostrando que los determinantes genéticos en la iniciación de los linajes primarios y satélites se combinan de diferentes maneras en la naturaleza. esta evaluación pionera y sistemática de la abundancia de estomas en a. Thaliana descubre la existencia de variación natural críptica en un proceso de desarrollo, detecta relaciones relevantes entre los caracteres estomáticos e identifica accesiones con fenotipos extremos o poco frecuentes que serán herramientas muy valiosas para la comprensión del desarrollo estomático en germoplasma natural. Una descripción detallada de este trabajo se encuentra en la publicación: dolores delgado, carlos alonso-blanco, carmen fenoll y montaña mena. 2011.Natural variation in stomatal abundance of arabidopsis thaliana includes cryptic diversity for different development processes. Annals of botany, doi: 10.1093/aob/mcr060. en el capítulo 3 se aborda la identificación de loci implicados en la variación cuantitativa de la abundancia de estomas entre accesiones silvestres de a. Thaliana. Para ello se utiliza una aproximación genética cuantitativa denominada análisis de loci de caracteres cuantitativos o análisis de qtls. El análisis de qtls nos permite diseccionar la arquitectura genética de un rasgo cuantitativo (tanksley, 1993; doerge, 2002; alonso-blanco y col, 2006) mediante la identificación del número y posición de loci que controlan un carácter de interés, la estimación de sus efectos y el modo de acción de cada qtl, la detección de relaciones de epistasia entre ellos, identificación de posibles interacciones de los qtls con el ambiente y el establecimiento potencial de efectos pleiotrópicos en varios caracteres (remington y purugganan, 2003; tonsor y col., 2005; alonso-blanco y col., 2006; lefebvre y col., 2009). Este tipo de aproximación ha sido ampliamente utilizada para la determinación de la arquitectura genética de múltiples caracteres cuantitativos relacionados con procesos de desarrollo en a. Thaliana (revisado por shindo y col., 2007; alonso-blanco y col., 2009), entre los que no se encuentra el desarrollo estomático. Por el contrario, el análisis de qtls para la abundancia de estomas sí se ha utilizado en otras especies como chopo (ferris y col., 2002) y arroz (ishimaru y col., 2001; laza y col., 2009), para las que se han encontrado regiones genéticas implicadas en el control del índice y la densidad estomática. Este tipo de análisis requiere de una población de cartografiado en la que se pueda observar la segregación de variantes en el carácter cuantitativo de interés (alonso-blanco y col., 2006). Las más usadas en el caso de a. Thaliana son las familias de líneas consanguíneas recombinantes (rils; burr y burr, 1997; alonso-blanco y koornneef, 2000; yano, 2001; alonso-blanco y col., 2006) y las líneas de introgresión (ils, eshed y zamir, 1995; alonso-blanco y col., 2006; keurentjes y col., 2007). Ambas poblaciones se consideran prácticamente homocigóticas, lo que les confiere una serie de ventajas, como la posibilidad de propagar estas líneas de manera indefinida, el no tener que genotipar las líneas posteriormente, el poder utilizar varios individuos del mismo genotipo para llevar a cabo nuestros análisis reduciendo así la influencia del ambiente en el carácter estudiado y el poder utilizarlos en numerosos experimentos en múltiples condiciones ambientales (alonso-blanco y koornneef, 2000; alonso-blanco y col., 2006; keurentjes y col., 2007). nuestro estudio es el primero que aborda la disección genética de la abundancia de estomas mediante el análisis de la variación natural intraspecífica entre dos accesiones de a. Thaliana, landsberg erecta (ler, un parental frecuente de líneas consanguíneas recombinante) y la accesión silvestre llagostera (ll-0). Se utilizó una colección de 139 líneas consanguíneas recombinantes ler/ll derivadas del cruzamiento entre ler y ll-0, proporcionadas por el dr. Carlos alonso blanco (sánchez-bermejo, 2008). El análisis complementario del ie, de y dp realizado en los parentales y en los individuos híbridos f1 obtenidos a partir de cruzamientos recíprocos entre ler y ll-0 sugiere que las diferencias encontradas en los caracteres relacionados con la abundancia de estomas entre estos dos genotipos se deben fundamentalmente a factores genéticos, aunque se observan efectos moderados maternos en el control de la de, que también contribuyen sustancialmente en la dp. Los valores de heredabilidad en torno al 70%, la variación transgresiva en ambas direcciones observada en la población de rils ler/ll-0 y las fuertes correlaciones establecidas entre los caracteres analizados sugieren que los mecanismos genéticos, constituidos por variantes alélicas con efectos negativos y positivos, son los principales contribuyentes a la variación observada en ie, de y dp en esta población de rils. El análisis de qtls realizado a partir del ie, de y dp de las 139 rils ler/ll-0 nos ha permitido identificar cinco regiones genéticas implicadas en los procesos que determinan la abundancia de células epidérmicas y su proporción en las epidermis adaxiales de cotiledones. En tres de estas regiones colocalizaron qtls que afectan a todos los caracteres analizados, por lo que probablemente corresponden a los mismos loci; por ello, dichas regiones genómicas fueron nombradas mida (modulator of cell index and density). Mientras, en las dos regiones restantes colocalizaron qtls con efectos específicos sobre de o dp, y en consecuencia se denominaron msd (modulator of stomatal density) y mpd (modulator of pavement cell density), respectivamente. En adelante, cada uno de estos qtls será mencionado de acuerdo a estas denominaciones genéricas, seguidas de un número que corresponderá con el del cromosoma en el que se localiza. una vez identificadas y localizadas las regiones genéticas con efecto sobre la abundancia de estomas, se procedió a la caracterización genética de dos de los qtls con mayor efecto sobre los caracteres estudiados, mida2 y mida3. mida2 localizó en torno a la posición de 50 cm del cromosoma 2, estrechamente ligado al locus erecta (er), que segrega en las rils ler/ll-0 debido a que ler porta el alelo de pérdida de función er-1. El ligamiento de mida2 a er, la frecuente asociación de alelos de pérdida de función con qtls de efecto mayor y la descrita implicación de er en procesos de proliferación y expansión celular (masle y col., 2005; shpak y col., 2005; tisné y col., 2008), sugerían conjuntamente que er podría ser el gen causal de mida2. El análisis de los caracteres ie, de y dp en varios mutantes er (en distintos fondos genéticos) y en sus respectivos ancestros silvestres demuestran que erecta regula negativamente tanto la proporción como la densidad de tipos celulares en la epidermis adaxial del cotiledón y que su efecto es consistente con el de mida2 para estos tres caracteres, apoyando la relación causal entre er y mida2, si bien no excluyen la contribución de otros polimorfismos entre ler y ll-0 que pudieran existir en el intervalo cromosómico adscrito a mida2. Por otra parte, el estudio detallado del papel de erecta en el control de la proporción y densidad de tipos celulares en epidermis adaxiales y abaxiales de cotiledones y primeras hojas indica que er es un regulador negativo de la densidad de células estomáticas y no estomáticas en ambas epidermis de cotiledones y hojas del primer verticilo. Así mismo, muestran que er regula además negativamente la proporción de células epidérmicas que son estomas en la epidermis adaxial. Igualmente, evidencian que las superficies epidérmicas de un mismo órgano tienen diferentes requerimientos de er para la correcta progresión de los linajes estomáticos hasta la diferenciación de los estomas, siendo necesaria en la abaxial y prescindible en la adaxial. Finalmente, revelan un patrón fenotípico mutante claramente distinguible del silvestre que nos permite asociar fenotipos estomáticos y celulares concretos con alteraciones funcionales de er. El análisis del fenotipo mutante er también identifica diferencias entre los distintos alelos estudiados en función de la lesión que afecte a la proteína, distinguiendo fenotipos suaves o singulares que reflejan una severidad diferencial del fenotipo en función del carácter y de la superficie epidérmica examinada. Además, nuestro análisis identifica alelos naturales de er en van-0 que explican los altos valores de ie, de y dp registrados en esta población natural, conforme a los resultados publicados por van zanten y colaboradores (2009) en relación con el control del crecimiento hiponástico. en la región mida3 colocalizaron qtls para ie, de y dp con contribuciones significativas y relativamente sustanciales a la variación de estos caracteres en la población de rils analizada. El análisis de líneas de introgresión portadoras de una única región del parental ll-0 (25 cm aproximadamente) en fondo genético de lansberg en el intervalo de confianza asociado a mida3, confirma su participación en la modulación de la abundancia de estomas y el tamaño/densidad de las células del pavimento en la superficie adaxial del cotiledón. El alelo ll-0 aumenta la producción de estomas (ie y de) y disminuye el tamaño celular respecto al alelo de landsberg, aunque en el caso de la dp el efecto de mida3 depende de las condiciones ambientales en las que se desarrollen las plantas. Además, nuestros resultados indican que mida3 y erecta, en determinadas condiciones ambientales, interaccionan aditivamente en el control tanto de ie como de en la epidermis adaxial del cotiledón y sugieren un sinergismo en el control de la densidad/tamaño de células del pavimento. La cuantificación del índice y la densidad celular en las dos superficies de cotiledones y primeras hojas de plantas portadoras de fragmentos de introgresión ll-0 de distinto tamaño con efecto sobre la abundancia de estomas, indica que mida3 modula fundamental y consistentemente la abundancia de estomas en la superficie adaxial de los cotiledones. Estos resultados sugieren que mida3, por una parte, está asociado a mecanismos de heteroblastia y, por la otra, que su contribución no es homogénea entre superficies epidérmicas del mismo órgano. en la actualidad se está realizando el mapeo fino de mida3. Los últimos resultados obtenidos indican que el efecto principal de la región mida3-ll se debe a loci incluidos en torno a la posición de 7,6 mb y acotan la longitud de la región mida3 a unos 0,45 mb. El objetivo de futuras aproximaciones consistirá en seguir reduciendo la longitud de la región mida3-ll con efecto sobre la abundancia de estomas con el fin de avanzar hacia el clonaje posicional de los genes implicados. en la parte final del capítulo 3 se incluye un análisis cuantitativo del efecto de erecta y mida3 sobre la iniciación de linajes en la epidermis adaxial de cotiledón en desarrollo. Los resultados obtenidos sugieren que tanto erecta como mida3 regulan la abundancia de estomas mediante el control de los procesos relacionados con la producción de linajes satélites, aunque en el caso de mida3 el efecto es más tardío y sutil que el de erecta. Parece que ambos reguladores limitan la proporción de linajes primarios que producen las divisiones de espaciamiento que originan linajes satélites. La expresión temprana de erecta descrita por shpak y col. (2005) y el aumento significativo de la densidad de linajes primarios registrado a 3 dpg en los mutantes er, nos sugiere que la perdida de función de este receptor de membrana podría estar modificando también la producción de linajes primarios, aunque el parámetro utilizado para su análisis (índice) no nos permite acceder a dicha información. algunas señales ambientales -como la luz- intervienen en el desarrollo y en la distribución de los estomas (revisado por casson y gray, 2008; casson y y hetherington, 2010); estas señales modulan el número de estomas pero mantienen su correcto patrón de espaciamiento. La luz transmite información esencial sobre la disponibilidad de energía para la fotosíntesis, el acompasamiento del crecimiento a las estaciones, el ritmo circadiano y la presencia de competencia (revisado por chen y col., 2004; jiao y col., 2007; bou-torrent y col., 2008). En a. Thaliana, diversos estudios han vinculado la formación de los estomas con la luz que perciben los fotorreceptores, proceso en el que intervienen varios componentes del mecanismo fotomorfogénico. Frecuentemente, la pérdida de función de estos componentes es letal para las plántulas y produce alteraciones importantes del patrón de distribución estomática. Se sabe que constitutive photomorphogenic 10 (cop10) es un componente importante de dicho mecanismo y que la pérdida de su función da lugar a la formación de agrupamientos estomáticos. en el cuarto y último capítulo de la tesis, se analiza la relación entre el ambiente lumínico y el desarrollo estomático mediante el estudio del papel de cop10. Para ello se ha realizado un análisis cuantitativo y dinámico detallado del desarrollo estomático en la epidermis de los cotiledones del mutante cop10-1. Los resultados obtenidos revelan un fenotipo de sobreproducción estomática en el mutante cop10-1, donde la mitad de los estomas se forman independientemente de la luz en fases muy tempranas del desarrollo y el resto se deben a la formación progresiva de agrupamientos de estomas en fases más tardías. La obtención de impresiones seriadas a partir de cotiledones vivos y la posterior reconstrucción de la historia de las divisiones celulares identificadas, nos ha permitido realizar un análisis dinámico y cuantitativo de los tipos de linajes estomáticos formados durante el desarrollo de la superficie epidérmica. Los resultados se ajustan a un modelo en el que cop10 regula la iniciación y extensión de los linajes estomáticos (limitando las divisiones de entrada y estimulando las de amplificación), reprime el destino estomático y supervisa la orientación de las divisiones de espaciamiento en los linajes satélite, contribuyendo a la prevención de la formación de agrupamientos estomáticos. Por lo tanto, cop10 relaciona la fotomorfogénesis con la diferenciación y el patrón de distribución de los estomas, afectando al linaje (entrada y amplificación) y a la señalización celular (espaciamiento), ambos considerados mecanismos de desarrollo estomático. el análisis del patrón de expresión de la proteína tmm fusionada a gfp bajo el promotor tmm en fondo genético cop10-1, revela una acumulación anormal de la proteína en las células del linaje estomático con capacidad de proliferación. En ausencia de cop10, células que están en contacto con estomas muestran una expresión persistente del marcador. En los cotiledones silvestres, la expresión de tmm:gfp y la capacidad de proliferación desaparece de aquellas slgc que salen de la ruta estomática para entrar en la ruta de diferenciación de las células de pavimento, y las epidermis maduras de los cotiledones pasan a estar constituidas únicamente por estomas y grandes células de pavimento. En cop10-1, muchas de las células de los linajes (y a veces todas) producen estomas en vez de diferenciarse como células del pavimento. por otra parte, se ha observado que el mutante cop10-1 forma tricomas en la primera hoja y que tanto cotiledones como primeras hojas diferencian células de pavimento morfológicamente normales, lo que indica que cop10 ejerce su función específicamente en las células del linaje estomático y que los mutantes de pérdida de función cop10 parecen incapaces de inducir la diferenciación de estomas si los linajes no han sido establecidos previamente. Además, el hecho de que la acumulación de los agrupamientos estomáticos se produzca de forma gradual en cop10-1 sugiere que la pérdida de cop10 se hace más relevante conforme se van acumulando errores de destino celular y de espaciamiento en los linajes formados. Además, parece que los estomas de cop10-1 no están completamente diferenciados a pesar de que se forman en fases tempranas del desarrollo. En cotiledones cop10-1 de 6 dpg, las células de guarda no adquieren la morfología elíptica característica que se encuentra en las plantas silvestres; por el contrario, su morfología es aberrante con poros muy grandes y estomas con forma de rosquilla. Estas observaciones contrastan con el hecho de que los estomas agrupados de cop1-5, otro mutante fotomorfogénico, expresan el marcador e1728, específico de células de guarda maduras (kang y col., 2009). Aún está por determinar si estas diferencias de deben a los efectos de genes específicos o a las diferencias en las condiciones de crecimiento utilizadas. en la actualidad se ha establecido que varios genes cuyos productos participan en el mecanismo fotomorfogénico son reguladores negativos de la diferenciación de estomas. En este trabajo, se identifican algunos de los eventos específicos del desarrollo estomático que son controlados por cop10, en los que se incluyen distintas divisiones celulares y eventos de diferenciación específicos. Todos estos hallazgos ayudarán en futuros trabajos a identificar los mecanismos concretos que median el control lumínico del desarrollo de estomas. En la actualidad, este trabajo está siendo revisado para su publicación en la revista planta (javier torres-contreras, dolores delgado, isabel ballesteros, montaña mena y carmen fenoll, dynamic analysis of epidermal cell divisions identifies specifiv roles for cop10 in arabidopsis stomatal lineage development, en revisión).
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudio de variantes genéticos naturales e inducidos de arabidopsis thaliana para identificar genes implicados en el desarrollo de estomas y en su regulación por luz.«
- Título de la tesis: Estudio de variantes genéticos naturales e inducidos de arabidopsis thaliana para identificar genes implicados en el desarrollo de estomas y en su regulación por luz.
- Autor: María Dolores Delgado Delgado
- Universidad: Castilla-la mancha
- Fecha de lectura de la tesis: 11/07/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Montaña Mena Marugan
- Tribunal
- Presidente del tribunal: pilar Carbonero zalduegui
- rosa adela Arroyo García (vocal)
- José Antonio Jarillo quiroga (vocal)
- Carlos Alonso blanco (vocal)