Tesis doctoral de Susana Ruiz Ruiz
Resumen el virus de la tristeza de los cítricos (ctv): desarrollo y aplicación de herramientas para establecer un sistema genético eficaz las cepas de ctv comunes en españa son poco agresivas y sólo producen decaimiento de plantas propagadas sobre naranjo amargo, mientras que en otros países predominan cepas más virulentas que producen los síndromes de amarilleo (sy) y acanaladuras en la madera (sp) en pomelo o naranjo dulce, con independencia del patrón utilizado. El objetivo general de esta tesis era el desarrollo de herramientas para controlar los aislados más virulentos de ctv. Para ello, se inició la puesta a punto de un sistema genético eficaz que permitiera caracterizar los determinantes genéticos de los síntomas de sy y sp. Por otra parte, se desarrolló un método para identificar los aislados de ctv potencialmente peligrosos, mediante la detección y cuantificación de variantes de secuencia características de los aislados más virulentos. como base del sistema genético se seleccionó el aislado de origen español t318a, que induce sy y sp en pomelo y naranjo dulce y que presentaba una población viral muy homogénea. La secuenciación de su rna genómico (grna) mostró que éste presenta una organización idéntica a la del resto de aislados de ctv secuenciados y potencialmente codifica productos similares. T318a mostró alta identidad nucleotídica con los aislados más agresivos de los que se conoce la secuencia completa (sy568r y nuaga). En contraste con otros aislados virulentos, t318a es el primer aislado en el que se detecta una única variante de secuencia en la región no codificante 5¿ utr (tipo ii). Otra peculiaridad de t318a es la presencia en su población de varios rnas defectivos (drnas) de gran tamaño, que podrían tener capacidad de replicación autónoma. se desarrolló un protocolo de rt-pcr cuantitativa a tiempo real que permite estimar de forma fiable el número de copias de grna de ctv para poder evaluar la eficacia replicativa de los futuros clones de cdna. Con este fin se diseñó una pareja de cebadores en regiones conservadas en las orfs 1b y 2 que evita la amplificación de los rnas subgenómicos y los drnas más abundantes de ctv. Este protocolo permite la detección y cuantificación reproducible de ctv en distintos tejidos y especies huésped incluso en árboles de campo. El análisis de las curvas de fusión de los productos amplificados mostró que el valor de tm permitía diferenciar los aislados poco agresivos de los más virulentos. La comparación de los valores tm de 56 aislados de ctv caracterizados biológicamente procedentes de 20 países diferentes, permitió identificar correctamente como agresivos o no agresivos el 90% de ellos. Sin embargo, la presencia de variantes de secuencia características de aislados agresivos y no agresivos en un mismo aislado da lugar a valores intermedios de tm que pueden dificultar una caracterización inequívoca. con objeto de identificar aislados potencialmente peligrosos sin esta limitación se desarrolló un nuevo protocolo de rt-pcr a tiempo real, utilizando tres sondas taqman tipo lna, que permite la detección y cuantificación de variantes de secuencia características de aislados no virulentos (nv), virulentos inductores de sp (sp) y virulentos tipo t36 (t36). El análisis del mismo panel internacional de aislados mostró: i) que los aislados no virulentos reaccionaban únicamente con la sonda nv, ii) que la sonda sp identificaba el 96% de los aislados inductores de sp, y iii) que la reacción con las sondas sp o t36 identificaba el 100% de los aislados virulentos (inductores de sy y/o sp). Este protocolo se aplicó al estudio de la población viral de plantas co-inoculadas sucesivamente con un aislado no virulento (t32) y otro inductor de sp (t318a). El análisis mostró que t32 no protegía las plantas pre-inoculadas frente al sp inducido por t318a y que cada variante de secuencia invadía los tejidos previamente infectados por la otra. para el desarrollo de un sistema genético basado en el genoma de t318a se ensayó en primer lugar la capacidad de este genotipo para replicarse en protoplastos de nicotiana benthamiana. La inoculación de éstos con viriones purificados de t318a dio lugar a una acumulación viral similar a la observada previamente con viriones del aislado t36. Por otra parte, para facilitar la construcción de un cdna infeccioso del genoma completo de t318a se decidió construir un minireplicón basado en alguno de los drnas de gran tamaño detectados en este aislado. La secuenciación de las regiones próximas al punto de recombinación de tres drnas mostró que su región 5¿ incluía las orfs 1a y 1b completas, confirmando su capacidad de replicación autónoma y la posibilidad de utilizarlos como minireplicones naturales. Sin embargo, ninguno de los clones ensayados dio lugar a transcritos capaces de replicarse en protoplastos de n. Benthamiana, lo que sugería una posible reorganización de dichos clones inducida por su toxicidad para las bacterias. Para obviar este problema se obtuvieron nuevos clones de cdna que se pudieron expresar directamente in planta bajo la acción del promotor 35s del virus del mosaico de la coliflor (camv) en un vector binario de bajo número de copias y con la pauta de lectura de la orf 1a interrumpida por la inserción de un intrón de planta. La agroinfiltración de estos clones en hojas de n. Benthamiana dio lugar a una replicación eficiente y a una acumulación de rna viral similar a la observada con minireplicones de t36. A partir de los minireplicones más eficientes se obtuvieron clones de longitud completa de t318a insertándoles la región central del genoma que les faltaba. Todos los clones completos de t318a se replicaron en hojas agroinfiltradas de n. Benthamiana, aunque su cinética de acumulación fue diferente a la de t36: mientras la acumulación de éste en las hojas infiltradas aumentó progresivamente e indujo una infección sistémica, la de t318a aumentó las dos primeras semanas para luego descender hasta hacerse indetectable. La co-infiltración de los clones completos de ambos aislados no consiguió un incremento en el número de copias de t318a o el movimiento de éste a hojas superiores.
Datos académicos de la tesis doctoral «El virus de la tristeza de los cítricos (ctv): desarrollo y aplicación de herramientas para establecer un sistema genético eficaz«
- Título de la tesis: El virus de la tristeza de los cítricos (ctv): desarrollo y aplicación de herramientas para establecer un sistema genético eficaz
- Autor: Susana Ruiz Ruiz
- Universidad: Universitat de valéncia (estudi general)
- Fecha de lectura de la tesis: 25/03/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- José Guerri Sirera
- Tribunal
- Presidente del tribunal: amparo Latorre castillo
- ricardo Flores pedauye (vocal)
- Jesús Navas castillo (vocal)
- Miguel angel Aranda regules (vocal)