Tesis doctoral de Daniel Ruiz Abanades
Abstract ………………………………………………………………………. 1 abreviaturas ……………………………………………………………….. 3 introducción……………………………………………………………….. 5 1.- Leishmania. ……………………………………………………………………… 7 1.1.- Ciclo de vida …………………………………………………………………………….. 7 1.2.- La leishmaniosis…………………………………………………….. 9 1.2.1.- La leishmaniosis en españa………………………………………………………………. 10 1.3.- Biología molecular de leishmania. ……………………………………………………… 11 1.3.1.- El genoma…………………………………………………………. 11 1.3.2.- Expresión génica …………………………………………………………………………….. 13 1.3.3- regulación de la expresión génica……………………………………………………… 17 1.3.3.1.- Procesamiento de los arnm. ………………………………………………………… 17 1.3.3.2.- Estabilidad de mensajeros ……………………………………………………………… 18 1.3.3.3.- Traducción de mensajeros……………………………………………………………… 19 2.- El ciclo celular………………………………………………………………………….. 21 2.1.- Control del ciclo celular ……………………………………………………………………… 21 2.2.- Control de la expresión génica asociado a la fase s………………………………… 23 3.- Las histonas…………………………………………………………………… 26 3.1.- Control de la expresión génica de las histonas……………………………………….. 27 3.2.- Las histonas de leishmania ………………………………………………………………… 29 3.2.1.- Organización génica de las histonas de leishmania …………………………….. 31 3.2.2.- Expresión génica de las histonas de leishmania …………………………………. 32 objetivos…………………………………………………………………… 35 materiales y métodos…………………………………………………………………………… 39 1.- Cultivo de parásitos………………………………………………………………………… 41 2.- Tratamientos con hidroxiurea y actinomicina d. …………………………………….. 41 3.- Transfección de promastigotes……………………………………………………………….. 41 4.- Construcciones plasmídicas. ………………………………………………………………….. 42 5.- Reacción en cadena de la polimerasa (pcr)…………………………………………….. 46 6.- Mapeo de arnm por rt-pcr. ……………………………………………………………… 47 7.- Secuenciación de adn. ………………………………………………………………………… 47 8.- Preparación de células competentes y transformación……………………………….. 47 9.- Aislamiento de adn de plásmidos…………………………………………………………. 48 10.- Aislamiento de arn de leishmania……………………………………………………… 48 11.- Análisis de la distribución de arnm en polisomas por gradientes de sacarosa. ………………………………………………………………. 48 12.- Electroforesis de arn y transferencia a membrana. ……………………………….. 48 13.- Marcaje radiactivo de adn de cadena doble. ………………………………………… 49 14.- Marcaje radiactivo de oligodesoxirribonucleótidos. ……………………………….. 50 15.- Hibridación de filtros. …………………………………………………………………………. 50 16.- Marcaje de proteínas de nueva síntesis. …………………………………………………. 51 17.- Aislamiento de núcleos. ………………………………………………………………………. 51 18.- Inmunoprecipitaciones. ………………………………………………….. 51 19.- Electroforesis de proteínas. ………………………………………………………………….. 53 20.- Ensayos de western blot. …………………………………………………………………….. 53 21.- Citometría de flujo y análisis del ciclo celular………………………………………… 54 23.- Análisis de las bases de datos……………………………………………………………….. 55 resultados …………………………………………………………….. 57 1.- Análisis de la expresión del gen h2a4 mantenido de forma episómica. ………. 59 2.- Estudio de la implicación de la región codificante y de las diferentes regiones no traducidas en el control traduccional de los genes de histonas de l. Infantum……………………………………………………………………… 64 3.- Estudio del papel de las regiones 5″utr y 3″utr en el control por ciclo celular de la histona h2a de l infantum…………………………………………………. 68 4.- Análisis de la presencia de los elementos hre y ccre en histonas y otros genes de expresión asociada a la fase s en l. Infantum. ……………………………. 70 5.- Efecto de la delección del elemento hre del gen h2a4 de l. Infantum………. 72 6.- Análisis del efecto de las delecciones parciales de hre en la expresión asociada al ciclo celular del gen 6xhish2a. …………………………………………….. 75 7.- Análisis de la implicación de ccre y hre en la estabilidad del arnm…….. 80 8.- Búsqueda del elemento hre en genes de histonas de otros tripanosomátidos. …………………………………………………………. 82 9.- Análisis del comportamiento traduccional de otros genes de expresión asociada al ciclo celular………………………………………………………………………… 84 discusión…………………………………………………………………… 85 1.- La expresión del gen h2a mantenido como episoma mantiene el control de la expresión génica asociada al ciclo celular……………………………………….. 87 2.- Implicación de las diferentes regiones génicas en el control de las histonas asociado al ciclo celular. ………………………………………………………………………. 91 3.- Hre es esencial para la represión traduccional y la acumulación de los tránscritos fuera de la fase s………………………………………………………………….. 94 4.- Modelo de acción de hre y ccre en la región 3″utr de las histonas. …….. 99 conclusiones…………………………………………………………………. 101 bibliografía……………………………………………………………… 105
Datos académicos de la tesis doctoral «Control de la expresión génica de las histonas de leishmania asociado al ciclo celular«
- Título de la tesis: Control de la expresión génica de las histonas de leishmania asociado al ciclo celular
- Autor: Daniel Ruiz Abanades
- Universidad: Autónoma de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 13/02/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Manuel Soto Alvarez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Carlos Alonso bedate
- araceli Del arco Martinez (vocal)
- victor Manuel Gonzalez muñoz (vocal)
- Miguel angel Navarro carretero (vocal)