Tesis doctoral de Tania Matamoros Grande
La retrotranscriptasa (rt) es una enzima clave en el ciclo de replicación del virus de la inmunodeficiencia humana (vih). Es una enzima multifuncional que presenta actividades dna polimerasa dependiente de rna y de dna y actividad endonucleasa, además de capacidad de cambio de molde y desplazamiento de cadena. La rt del vih-1 es un heterodímero formado por dos subunidades de 66 y 51 kda, respectivamente. La retrotranscripción es un proceso que presenta una elevada tasa de error que contribuye a la alta variabilidad genética de los retrovirus. Una de las consecuencias de las altas tasas de mutación ha sido la aparición de variantes de vih resistentes a fármacos antirretrovirales. Con el aumento en la complejidad de los tratamientos antirretrovirales se han identificado aislados virales que presentan nuevos patrones mutacionales que confieren altos niveles de resistencia a inhibidores análogos a la rt, entre ellos, inserciones en la horquilla beta3-beta4 de la rt del vih-1. Rts que presentan la combinación de una inserción de dos aminoácidos y mutaciones de resistencia a análogos a timidina confiere una actividad fosforolítica dependiente de atp que facilita el rescate del inhibidor de iniciadores bloqueados con azt o d4t. Uno de los objetivos de esta tesis ha sido la identificación de los determinantes moleculares implicados capacidad de escisión de rts del vih-1 que contienen una inserción de dos aminoácidos en la horquilla beta3-beta4. La horquilla beta3-beta4 juega un papel importante en la resistencia a inhibidores análogos a nucleótido y además, modula la fidelidad de copia de la rt debido a sus interacciones con el complejo molde-iniciador. En este trabajo, se ha estudiado el papel de la val-75 en la fidelidad de síntesis de dna bajo condiciones de estado estacionario y preestacionario y usando ensayos genéticos. en esta tesis doctoral se demuestra que la sustitución de la tyr-215 por thr, ser o asn en una rt multirresistente que contien una inserción ser-ser entre los codones 69 y 70 (rt ss), conduce a una resensibilización a azt y d4t a través de la pérdida de actividad fosforolítica dependiente de atp. Los resultados sugieren que la tyr-215 está implicada en el posicionamiento correcto del donador de ppi necesario que se produzca la reacción de escisión. También se ha demostrado que los átomos de oxígeno del fosfato gamma del atp, que actúa como molécula donadora de ppi en la reacción de escisión, son importantes para mantener la eficiencia de esta reacción. Además, el mecanismo de escisión y por tanto la resistencia a azt de la rt ss fue completamente eliminada, cuando se usó como inhibidor el azt-trifosfato con un azufre en su fosfato alfa. Estos datos sugieren una posible estrategia para interferir en la reacción de escisión de enzimas multirresistentes. Finalmente, se ha observado que el cambio de val por lle o phe en la posición 75, produce un aumento de 1,8 y 3 veces respectivamente, en la fidelidad de copia de la rt del vih-1, en ensayos genéticos. Los estudios cinéticos, tanto en estado estacionario como pre-estacionario, demuestran que dichas mutaciones no alteran la capacidad de la enzima para discriminar entre nucleótidos correctos e incorrectos, pero sí disminuye la capacidad de éste para extender extremos desapareados (etapa necesaria para la fijación de mutaciones). Sin embargo, el mutante con el cambio v75a es 1,4 veces menos fiel que la enzima bh10 en un ensayo genético. Los ensayos cinéticos muestran que en esta disminución de fidelidad de copia están implicadas las dos etapas que llevan a la fijación de mutaciones.
Datos académicos de la tesis doctoral «Determinantes moleculares implicados en la resistencia a análogos a timidina y en la fidelidad de copia de la retrotranscriptasa del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1.«
- Título de la tesis: Determinantes moleculares implicados en la resistencia a análogos a timidina y en la fidelidad de copia de la retrotranscriptasa del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1.
- Autor: Tania Matamoros Grande
- Universidad: Autónoma de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 31/03/2008
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Luis Menendez Arias
- Tribunal
- Presidente del tribunal: enrique Tabares lopez
- cecilio López galíndez (vocal)
- Luis Blanco dávila (vocal)
- José ignacio Rodríguez crespo (vocal)