Tesis doctoral de Elizabeth Diago Navarro
Null kid, la toxina del sistema de mantenimiento pard (kis, kid) del plásmido r1, es una endoribonucleasa de baja especificidad y un inhibidor de síntesis de proteínas. Kid corta el arn con preferencia, a 5¿ de la primera a en la secuencia 5¿-ua(a/c)-3¿. Se ha propuesto que la actividad arnasa de kid es similar al de las arnasas a y t1. El mecanismo se ha establecido en base al análisis de los productos de corte del arn y de una estructura modelada de un complejo de la toxina kid con el substrato 5¿- aduaca-3¿. Se supone que la inhibición de la síntesis de proteínas por kid se debe a la rotura del arnm y que ésta, ocurre de una manera independiente de la traducción. en esta tesis se ha realizado una evaluación del modelo de rotura del arn por ki d. Esta evaluación se ha llevado a cabo analizando por espectrometría de masas, la unión y rotura del substrato, de proteínas con mutaciones en residuos claves del modelo. Las mutaciones r73h, d75e, d75n y h17p, que afectan a residuos del centro cata lítico propuesto, inactivan la toxicidad de la proteína. Ensayos de corte realizados con los sustratos 5¿-auaca-3¿ y 5¿-uuacu-3¿, indican que las mutaciones anulan la actividad arnasa de la toxina sin afectar a su capacidad de unión al sustrato 5¿-ad uaca-3¿. el modelo también propone la existencia de dos superficies simétricas de unión a arn en el dímero de la toxina, e identifica residuos implicados en la unión general del sustrato, como r85, o en interacciones específicas con las bases de la secuencia consenso 5¿-ua(a/c)-3¿, como a55, t46 y t69. Esta propuesta se ha evaluado analizando la interacción con el arn y la actividad arnasa de variantes de kid con mutaciones en dichos residuos. El análisis indicó que los mutantes interaccionaban con el substrato con menor eficiencia que la proteína silvestre. Las mutaciones a55g y t69g, mostraron una actividad arnasa reducida pero medible, sin embargo, inesperadamente, la mutación t46g inhibió completamente el corte del substrato. La prote ína kidr85w mostró una reducción más drástica que las proteínas mutantes kida55g y kidt69g en su unión a arn y en su actividad arnasa. Los mutantes que retenían actividad arnasa, mostraron, también, inhibición de la síntesis de proteínas in vitro y d e la toxicidad in vivo. Los resultados apoyan el modelo propuesto e indican que t46 es un residuo de unión a arn que participa más directamente en la actividad arnasa de la toxina. el descubrimiento accidental de mutaciones en el gen prfa, abrió la p
Datos académicos de la tesis doctoral «Evaluación del mecanismo de corte del rna por la toxina bacteriana kid y de su actividad inhibidora de la traducción.«
- Título de la tesis: Evaluación del mecanismo de corte del rna por la toxina bacteriana kid y de su actividad inhibidora de la traducción.
- Autor: Elizabeth Diago Navarro
- Universidad: Complutense de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 27/11/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Ramón Díaz Oreja
- Tribunal
- Presidente del tribunal: cecilia Arraiano
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