Tesis doctoral de Elena Vuelta Lopez
La cornea, transparente y avascular, es un elemento esencial para asegurar una correcta capacidad visual. Su region mas anterior, el epitelio, se encuentra sometido a procesos de descamacion, que implican la existencia de un mecanismo de renovación y/o reparacion que asegure un recambio celular continuo. Dicho mecanismo se produce gracias a la existencia de una poblacion de celulas madre, las celulas madre epiteliales del limbo (cmel), localizadas en la region mas basal del limbo esclerocorneal o nicho de las cmel. En situaciones patologicas en las que la poblacion de las cmel esta ausente o disminuida, este proceso de recambio celular se ve interrumpido, produciendose lo que se conoce como sindrome de insuficiencia limbica (sil). Como alternativa terapeutica a este tipo de alteraciones de la superficie ocular, en los últimos anos han tomado gran importancia las tecnicas de terapia celular que implican el trasplante de cmel expandidas ex vivo. en este estudio, se ha definido en el cerdo como animal de experimentacion, la construccion de un sustitutivo del tejido limbar de naturaleza autologa, el gfcl o gel de fibrina que contiene celulas del limbo, fabricado a partir de plasma y los dos principales componentes celulares del tejido limbar, celulas epiteliales y fibroblastos estromales. Con el fin de conseguir optimizar la metodología referente al aislamiento de ambos tipos celulares a partir de una unica biopsia de tejido limbar porcino, se ha desarrollado un nuevo protocolo de digestion de las biopsias de tejido limbar, el protocolo invertido (pinv), consistente en la accion combinada de dos enzimas, la colagenasa de tipo i y soluciones de tripsina/edta (t/e). la naturaleza de las poblaciones celulares aisladas y cultivadas ha sido confirmada mediante estudios de expresion de marcadores proteicos mediante inmunofluorescencia, definiendo a las celulas epiteliales como pancitoqueratina positivas, mientras que la ausencia de expresion de este tipo de marcador establecio la naturaleza estromal de las poblaciones celulares de morfología fibroblastica. A su vez, el mantenimiento de determinadas caracteristicas propias de estos tipos celulares durante el periodo de cultivo in vitro fue determinada mediante el estudio de la expresion de marcadores de diferenciacion celular como la aldh1a1, la ¿-sma, el colageno de tipo ii, la cx43, la desmpolaquina y la integrina íY1. utilizando el pinv se ha conseguido el aislamiento de manera independiente de las celulas del estroma y el epitelio del limbo, generando suspensiones celulares viables, que condujeron a un elevado porcentaje de exito en el establecimiento de cultivos primarios de ambos tipos celulares. Las celulas cultivadas mantenian un fenotipo caracteristico, expresando los marcadores proteicos estudiados de manera mas similar a las celulas del tejido nativo. los gfcl construidos mostraban una correcta adhesion y proliferacion de las células estromales y epiteliales, tanto en su interior como en su superficie, respectivamente, mostrando al final del periodo de cultivo una resistencia y elasticidad adecuada. Los estudios realizados mediante tecnicas de histología convencionales, asi como microscopia electronica de barrido, revelaron una correcta dispersion de las células mesenquimales en el interior de los geles de fibrina, mientras que en la superficie de los gfcl se podia apreciar a los 14 dias de cultivo una pelicula de celulas epiteliales sobre el sustitutivo estromal o gel de fibrina que contiene fibroblastos (gff), mostrando pequenos signos de estratificacion. en definitiva, se ha podido construir un sustitutivo limbar de naturaleza totalmente autologa mediante tecnicas de ingenieria tisular que combinan la fibrina aislada de muestras de plasma fresco congelado y las celulas epiteliales y estromales procedentes de una unica muestra del tejido limbar. Asi, se ha generado un tejido de características histologicas similares al limbo porcino, el cual puede ser de gran utilidad no solo para el estudio de las interacciones que mantienen el microambiente propio de las cmel sino tambien como sustitutivo limbar de posible aplicacion terapeutica en el tratamiento de patologías de la superficie ocular que ocasionan ceguera corneal y que tienen en su patogenia un sil.
Datos académicos de la tesis doctoral «Ingenieria de tejidos en la reconstruccion de la superficie ocular: utilizacion de matrices de fibrina como nicho de celulas madre corneales«
- Título de la tesis: Ingenieria de tejidos en la reconstruccion de la superficie ocular: utilizacion de matrices de fibrina como nicho de celulas madre corneales
- Autor: Elena Vuelta Lopez
- Universidad: León
- Fecha de lectura de la tesis: 13/11/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Francisco Javier Iglesias Muñoz
- Tribunal
- Presidente del tribunal: José Carlos Pastor jimeno
- emiliano Hernández galilea (vocal)
- yolanda Diebold luque (vocal)
- José Luis Pedraz muñoz (vocal)