Tesis doctoral de Cosano Maya Inmaculada C.
La levadura metilotrófica pichia pastoris ha sido empleada de manera satisfactoria para la expresión de proteínas heterólogas, tanto intracelulares como de secreción.Como sistema de expresión es muy similar a saccharomyces cerevisiae, pero presenta ciertas ventajas, entre ella sunas modificaciones psot-traduccionales más parecidas a las que tienen las células eucriotas superiores. en nuestro laboratorio se ha desarrollado un sistema para la liberación de proteínas heterólogas basado en el empleo de mutantes autolíticos de s. Cerevisiae, remediables osmoticamente, que lisan a latas temperaturas. estos mutantes son deficientes en el gen slt2, una map quinasa responsable de la integridad celular.Dichos mutantes son capaces de liberar las proteínas intracelulares en ausencia de estabilizador osmótico. Estas proteínas pueden ser separadas fácilmente de los restos celulares por simple centrifugación. con el objeto de ampliar este sistema a p. Pastoris clonamos el gen homólogo a slt2 (pim1) de esta levadura mediante hibridación en colonia, empleando como sonda un fragmento de dicho gen amplificado por pcr, utilizando oligonuclotidos degenerados de zonas conservadas en map quinasas. la proteína pim 1 de p. Pastoris presenta todas las características estructurales de las proteína quinasas, así como las secuencia característica tey de regulación de map quinasas. La interrupción de este gen origina el mismo fenotipo que el que presentna los mutantes slt2 de s. Cerevisiae; autólisis a 37ºc y sensibilidad a caféina, ambos remediables en presencia de un estabilizador osmótico. A pesar de que pim1 en p. Pastoris se activa en preencia de los mismo estímulos qu eactivan slt2 de s. Cerevisiae, el gen pim1 no complementa los defectos utantes slt 2 de cervisiae. tras su incubación a 37ºc y un posterior choque osmótico, los mutantes pim 1 que expresan la proteína modelo b-lactamasa liberan un 60% de la proteína heter
Datos académicos de la tesis doctoral «Pim1, una map quinasa de integridad celular en pichia pastoris. utilización de los mutantes pim1 para la liberación de proteínas heterólogas«
- Título de la tesis: Pim1, una map quinasa de integridad celular en pichia pastoris. utilización de los mutantes pim1 para la liberación de proteínas heterólogas
- Autor: Cosano Maya Inmaculada C.
- Universidad: Complutense de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 17/04/2001
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- María Molina Martín
- Tribunal
- Presidente del tribunal: césar Nombela cano
- Sánchez-puelles gonzález-carvajal José María (vocal)
- j. Heinisch jurgen (vocal)
- pablo Alvarez alvarez (vocal)