Tesis doctoral de Eva Huguet Gutierrez
En este trabajo se demuestra que los espermatozoides de ratón son capaces de captar genes, tanto en condiciones de cultivo (in vitro) como en circunstancias fisiológicas (in vivo). esto último, se ha conseguido mediante una técnica nueva que permite la inyección de genes en el conducto deferente. la incubación in vitro se realizó con espermatozoides, procedentes de la causa epididimaria y del conducto deferente de ratón, a una temperatura de 37 grados c y en una atmósfera con un 5% de co2. Con una concentración de 500 ng/ml de moléculas de dna en el cultivo. el procedimiento de inyección in vivo del dna en el conducto deferente de los ratones, es un proceso que evita una manipulación excesiva del gameto masculino y permite, que posteriormente a ella, ocurra una cópula normal. Esta técnica consistió en operar ratones machos adultos y sexualmente maduros. cada conducto deferente fue inyectado con 30-50 ul de la solución que contenía 500 ng/ml de dna (construcciones pmgh y cpv-1). las técnicas realizadas para localizar las moléculas de dna fueron: hibridación in situ fluorescente (fish), hibridación in situ sobre cortes de microscopía electrónica, algunas pruebas moleculares como slot blot semicuantitativo, pcr con dnas genómicos de espermatozoides y secuenciación de dna. posteriormente, se utilizó un nuevo plásmido que contenía la gfp (green fluorescent protein, gfp) para inyectar a los ratones, los cuales se dejaban recuperar hasta el día siguiente para ser cruzados con hembras normales. Algunas de estas hembras tuvieron crías, cuyo dna (extraído de una biopsia de la cola) fue analizado por pcr para detectar la presencia o ausencia de los genes foráneos inyectados, determinando así la presencia de individuos transgénicos. los resultados que se obtuvieron con la microscopía parecen indicar que aproximadamente un 70-80% de los espermatozoides de ratón son capaces de asociar el dna, y con l
Datos académicos de la tesis doctoral «Transfeccion in vivo de espermatozoides como un posible metodo para generar animales modificados geneticamente.«
- Título de la tesis: Transfeccion in vivo de espermatozoides como un posible metodo para generar animales modificados geneticamente.
- Autor: Eva Huguet Gutierrez
- Universidad: Autónoma de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 01/01/1999
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Pedro Esponda Fernandez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: nicolas Jouve de la barreda
- esther Ferrer cebrián (vocal)
- Jaime Gosalvez berenguer (vocal)
- Botella cubels m. Luisa (vocal)