Tesis doctoral de María Carmen Mulero Roig
Calcineurina (cn), la única serina treonina fosfatasa dependiente de ca2+ y calmodulina identificada hasta el momento, es una enzima clave en la regulación de diversas vías de señalización celular, entre ellas, la activación linfocitaria. Actualmente, los protocolos de inmunosupresión incluyen el uso de fármacos anticalcineurínicos, csa y fk506, pero su administración continuada comporta la aparición de graves efectos secundarios. En los últimos años se han descrito diversos inhibidores endógenos de cn, entre ellos la familia de las calcipresinas o regulators of calcineurin (rcan), que en humanos consta de tres miembros rcan1, rcan2 y rcan3. Hasta el momento de realizar este trabajo se había descrito que rcan1 interacciona e inhibe la actividad fosfatasa de cn respecto la familia de factores de transcripción nfat en diversos tejidos, pero no se había estudiado en linfocitos t humanos. Por ello, se decidió analizar la interacción de las proteínas rcan1 y rcan3 con cn en linfocitos t así como evaluar el potencial inmunosupresor de dichas interacciones respecto a la vía de señalización cn-nfat. los resultados obtenidos han mostrado que los transcritos rcan1-1 y rcan3-1,2,3,4,5 se expresan a nivel basal en líneas celulares de linfocitos t humanos, jurkat y hut78, mientras que el transcrito rcan1-4, no. Además, la expresión génica de rcan1-4 es mediada a través de una señal de ca2+-cn, mientras que la expresión de los otros dos transcritos analizados, no. Mediante experimentos de co-immunoprecipitación se ha podido demostrar que en células jurkat, la interacción rcan1-1-cn tiene lugar de manera endógena y mediante ensayos de pull down se han identificado los dos motivos de rcan 1-1 implicados, el motivo cic y el motivo pxlxxt. En el caso de rcan3-2, se ha descrito por primera vez que esta proteína sobreexpresada interacciona con cn y que lo hace únicamente a través de su correspondiente motivo cic. Ensayos funcionales in vivo han mostrado que únicamente el motivo cic de las rcan es el responsable directo de la inhibición de la vía de señalización cn-nfat. Como consecuencia, en células jurkat, se ha podido demostrar el potencial inmunosupresor del motivo cic de las rcan respecto la expresión génica de diversas citoquinas dependientes de nfat. El acotamiento del motivo cic de las rcan ha permitido identificar una secuencia de 21 aminoácidos, a la que se ha denominado c18, y que corresponde a la región mínima de las rcan capaz de inhibir la vía de señalización cn-nfat. las interacciones c18-rcan1-cn y c18-rcan3-cn han sido puestas a punto y caracterizadas in vitro mediante anisotropia de fluorescencia. Además, se ha demostrado que las proteínas rcan y nfat se interfieren en su interacción con cn y que probablemente las interacciones c18-rcan1-cn y c18-rcan3-cn no implican la participación directa del centro activo de cn. En conjunto, estos datos sugieren que el efecto inmunosupresor de las rcan sería más específico que el que promueven los fármacos inhibidores de cn, csa y fk506, utilizados actualmente. Con la finalidad de identificar nuevas moléculas con potencial inmunosupresor se realizaron diversos cribajes utilizando quimiotecas combinatorias que disruptaran la interacción c18-rcan1-cn. A partir de estos experimentos se han podido identificar cuatro hexapéptidos y un producto denominado idi3a que desplazan de manera dosis-dependiente la interacción analizada. La evaluación funcional del producto idi3a ha demostrado que éste inhibe in vivo la vía de señalización cn-nfat y que por tanto, tiene cierto efecto inmunosupresor. Estos datos indican que, tanto los péptidos c18 de las rcan como el ensayo in vitro que se ha diseñado, constituyen dos nuevas herramientas útiles en la búsqueda de moléculas con potencial inmunosupresor.
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudio de las proteínas rcan en la activación linfocitaria: aplicación en la búsqueda de nuevos fármacos inmunosupresores«
- Título de la tesis: Estudio de las proteínas rcan en la activación linfocitaria: aplicación en la búsqueda de nuevos fármacos inmunosupresores
- Autor: María Carmen Mulero Roig
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 31/01/2008
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Mercé Pérez Riba
- Tribunal
- Presidente del tribunal: enrique Perez paya
- lLuis Espinosa blay (vocal)
- catalina Casas louzao (vocal)
- josep María Grinyó boira (vocal)