Tesis doctoral de Javier Lopez Vidal
Con la producción de la primera molécula proteica recombinante, la industria farmacéutica ha empleado los productos biológicos de manera prioritaria frente a los sintetizados químicamente. Actualmente, ersas tecnologías recombinantes compiten por satisfacer la demanda de la industria, por lo que la ucción de los costes y la cantidad y funcionalidad de los productos generados son determinantes. La gía de expresión de vectores baculovirus bevs es un sistema de expresión de proteína recombinante eucariota versátil y robusto, muestra de ello son los productos generados y puestos ya en el mercado, principalmente vacunas. Sin embargo, la calidad y la cantidad de la proteína recombinante obtenida son, todavía, dos de los principales desafíos pendientes que restan competitividad a este sistema de presión. Objetivo de esta tesis fue dar un impulso a esta tecnología tratando de solventar algunas de sus principales desventajas. Para ello, se han caracterizado nuevos elementos genéticos reguladores omotores, transactivadores y secuencias enhancer que una vez combinados han permitido desarrollar un nuevo casete de expresión optimizado. Para llevar a cabo estos estudios se han empleado técnicas bioquímicas y de biología molecular y se han diseñado y analizado más de 40 nuevos baculovirus en cultivo celular sf21, sf9 y tn-5 y en larvas del insecto trichoplusia ni t. Ni. Entre los hallazgos, destaca la caracterización de nuevos promotores de expresión génica derivados de t. Ni para su uso en l vector baculovirus acmnpv, destacando el denominado pb2, por su actividad más temprana y homogénea que la del promotor de baculovirus polh. Además, la cooperación sinérgica entre esta secuencia y el promotor p10 del baculovirus pb2p10 resultó de interés biotecnológico. El análisis de la secuencia pb2 permitió la determinación de sus regiones esenciales fragmento pb29 en acmnpv. Además, se ha caracterizado funcionalmente la co expresión de una segunda copia de los actores reguladores ie1 e ie0 de acmnpv mediante la inserción en el genoma del virus del cdna ac ie 01, codificante para ambos factores. Como resultado se observó un mayor incremento del crecimiento de la población celular respecto a la infectada con el baculovirus convencional y un aumento de la pervivencia celular tras la infección, reflejado en una mayor viabilidad celular a tiempos tardíos posinfección. Por último, la generación de un casete de expresión compuesto por el cdna acie 01 y la secuencia intensificadora hr1 de acmnpv, operativamente unida alpromotor p10 o a híbridos de p10 con otros promotores, resultó en una mayor proliferación celular a tiempos tempranos de la infección, un mejor mantenimiento de la integridad celular a tiempos tardíos y en un incremento de la producción de proteína recombinante de hasta cuatro veces respecto a un vector baculovirus convencional, junto con una reducción de la proteólisis y de las formas proteicas aberrantes, características de este sistema. Además, la funcionalidad del nuevo casete se probó con éxito tanto con una proteína reportadora gfp como con una proteína vacunal de interés comercial proteína de la cápsida del circovirus tipo 2. En definitiva, el nuevo casete desarrollado confirió capacidades productivas no alcanzadas con anterioridad por esta tecnología. La proliferación celular en las primeras horas de la infección junto con el aumento de la viabilidad celular en su fase final, tienen como consecuencia un mejor procesamiento de las proteínas recombinantes obtenidas tanto en células de insecto como en larvas de t. Ni. Este casete de expresión se ha validado en un modelo de expresión de una proteína formadora de pseudopartículas víricas, obteniendo incrementos de productividad respecto a un baculovirus convencional del 400 por ciento en cultivo celular y del 200 por ciento en larvas del lepidóptero t. Ni.
Datos académicos de la tesis doctoral «Utilización de elementos regulares en cis y trans para la mejora de vectores baculovirus«
- Título de la tesis: Utilización de elementos regulares en cis y trans para la mejora de vectores baculovirus
- Autor: Javier Lopez Vidal
- Universidad: Complutense de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 26/06/2014
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Silvia Gómez Sebastián
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Jesús Perez gil
- joaquim Segalés i coma (vocal)
- María no Esteban rodriguez (vocal)
- Francisco Parra fernandez (vocal)