Tesis doctoral de María Teruel Artacho
Introducción todos los sistemas biológicos son susceptibles de ser invadidos por parásitos. Existe una enorme diversidad de relaciones parasíticas a los niveles inter- e intraespecífico. En el presente proyecto consideramos uno de los niveles inferiores de parasitismo, el intragenómico, que genera toda suerte de conflictos genéticos. Es el causado por los cromosomas b, cromosomas adicionales a los del complemento normal que se estima existen en, aproximadamente, el 15% de los eucariotas (camacho 2005). Los cromosomas b pueden originarse de diversas formas, ya sea derivados de los autosomas o de los cromosomas sexuales en cruzamientos intra- o interespecíficos. Su evolución molecular subsiguiente se asemeja a la de los cromosomas sexuales, ya que habitualmente implica el silenciamiento génico, la heterocromatinización y la acumulación de adn repetitivo y elementos transponibles. La frecuencia de cromosomas b en las poblaciones es el resultado de diversas fuerzas interactuantes, entre las que destaca su tasa de transmisión y sus efectos sobre la eficacia biológica del hospedador. Su evolución a largo plazo es el resultado de la selección sobre el genoma hospedador para eliminar a los bs o suprimir sus efectos, y sobre la capacidad de los bs para escapar de la eliminación mediante la generación de nuevas variantes (camacho y col. 1997, 2000). Puesto que los cromosomas b interactúan con los cromosomas estándar, juegan un papel importante en la evolución del genoma y pueden ser útiles para estudiar los procesos evolutivos al nivel molecular. El sistema de cromosomas b del saltamontes eyprepocnemis plorans ha iluminado las diferentes etapas del proceso evolutivo de estos cromosomas parásitos, aumentando enormemente el nivel de detalle de nuestra comprensión de su papel evolutivo. memoria en e. Plorans, estudios anteriores sugieren que los cromosomas b derivan del cromosoma x (lópez-león y col. 1994; cabrero y col., 2003). Para profundizar en el origen de estos cromosomas b hemos realizado la microdisección de los cromosomas x y b24 de e. Plorans para posteriormente buscar en ellos la presencia de determinadas secuencias mediante pcr. los cromosomas b se consideran elementos genéticamente inertes, pero eso no es consistente con la multitud de efectos descritos (camacho 2005). En relación con este aspecto, hemos analizado los patrones de acetilación de la histona h3, que indican el estado de potencial actividad génica de la cromatina. en cuanto al posible efecto de los cromosomas b sobre los individuos que los portan, en e. Plorans sólo se ha detectado efecto perjudicial del cromosoma b24 sobre la fertilidad de las hembras (muñoz y col. 1998; zurita y col. 1998). Así pues, para profundizar sobre este aspecto hemos estudiado el efecto de estos cromosomas a nivel celular e individual. A nivel celular, hemos analizado mediante citometría de flujo la morfología celular, la tasa de división celular y el nivel de apoptosis en varios tejidos. A nivel individual, hemos analizado posibles efectos sobre dos componentes celulares muy relacionados con el control del estrés y la actividad metabólica total: la proteína hsp70 y el nucleolo. resultados la microdisección la hemos realizado en un microscopio invertido, zeiss axiovert 200, acoplado a un micromanipulador electrónico, eppendorf transferman nk 2. El adn de estos cromosomas lo hemos amplificado con el kit genomeplex® single cell whole genome amplification de sigma. Este adn lo hemos marcado como sonda para su localización en los cromosomas mediante chromosome painting y lo hemos utilizado como adn molde para la amplificación mediante pcr de varias secuencias: los genes ribosómicos, concretamente los its del adn ribosómico 18/28s y los genes adnr 5s y los genes para las histonas h3 y h4. los patrones de hibridación obtenidos del chormosome painting indican que se ha amplificado preferentemente las secuencias heterocromáticas presentes en los cromosomas b y x. para la región de los its de los genes ribosómico hemos obtenido 4 familias de secuencias tras el alineamiento e inferencia por parsiomonia 5º estado de un árbol filogenético. El tipo de secuencias 1 y 2 corresponden a secuencias presentes en los cromosomas autonómicos, el grupo 3 es característico del cromosoma b y el grupo 4 del cromosoma x. Además, en el árbol obtenido se observan que las secuencias de adnr específicas del b (grupo 3) se asemejan más a la de los autosomas que a las del x, ya que las secuencias del x se encuentran formando un grupo separado. Un análisis más profundo del alineamiento de los its muestra que las principales diferencias que se observan se producen principalmente en varias zonas muy específicas del its-1, mientras que el its-2 esta mucho más conservado. Las secuencias de ribosómico específicas del cromosoma b son las más largas y presenta un mayor porcentaje de gc que las demás grupos de secuencias, debido principalmente a inserciones ricas en gc en el its-1 y que no aparecen en los otros grupos de secuencias. No se observan diferencias en las regiones más conservadas correspondientes a los genes 18s, 5,8s y 28s. Los 4 tipos de secuencias pertenecen a genes ribosómicos activos, no habiéndose detectado pseudogenes entre las secuencias analizadas. en el caso de los genes adnr 5s actualmente estamos finalizando su análisis y es aventurado establecer conclusiones definitivas las secuencias de las histonas h3 y h4 amplificadas a partir de adn genómico y de la microdisección del b son bastante similares, en contraste con las secuencias obtenidas a partir del adn del x, que mostraba más diferencias incluyendo sustituciones que incluso afectan a la secuencia de aminoácidos, altamente conservada en estas protéinas. Mediante experimentos de doble fish hemos establecido la localización de ambas secuencias en la región distal del cromosoma l2. los resultados obtenidos de la acetilación de la histona h3 a lo largo de toda la meiosis masculina muestra que los cromosomas b y la heterocromatina pericentromérica se encuentran hipoacetilados, lo que indicaría el silenciamiento de estas regiones (cabrero y col, 2007). en cuanto, al posible efecto de los cromosomas b, a nivel celular hemos estudiado mediante citometría de flujo la morfología celular, la tasa de división celular y el nivel de apoptosis en ganglio y gónadas de machos y hembras de este saltamontes con diferente número de cromosoma b. El estudio lo hemos realizado con individuos capturados en los años 2003 y 2005 en la población de torrox (málaga). Para ninguna de las dos muestras analizadas se observan diferencias en los parámetros de morfología celular, tasa de división celular y apoptosis entre individuos con diferente número de cromosoma b. por otro lado, hemos estudiando en la población de torrox el posible efecto que el número de cromosomas b puede tener sobre el número de nucleolos y el área nucleolar de células de la meiosis masculina. Este estudio lo hemos llevado a cabo en varios años, 1999, 2003 y 2004. Uno de los principales resultados obtenido ha sido la observación de nucleolo asociado al cromosoma b indicando la expresión de su adnr (teruel y col. 2007). También hemos estudiado mediante microscopia electrónica de transmisión el nucleolo de ganglio y gónadas de machos y hembras con y sin cromosoma b. la expresión de los cluster adnr del cromosoma b sugiere que los individuos portadores este cromosoma podrían estar sometidos a algún tipo de estrés genético o ambiental que conlleva la activación de estos genes, que normalmente esta inactivos. Por ello, hemos analizado los niveles de expresión de la proteína hsp70, proteína implicadas en el estrés, en testículo y ganglio de machos de la población de torrox con diferente número de cromosoma b. El análisis realizado muestra un efecto negativo del número de cromosomas b con respeto a los niveles de hsp70 en testículo, aunque para ganglio estas diferencias no se observan. Hemos completado este estudio con hembras adultas con diferente número de cromosomas b, aunque estos últimos datos los estamos analizando en este momento. discusión el análisis llevado a cabo de los its1 e its2 de gen adnr, muestra que no existe evolución concertada para esas secuencias en e. Plorans. En general, se observa una homogenización de la secuencia dentro de cada grupo, especialmente en los grupos 3 y 4 que corresponden a la secuencia específica del b y del x respectivamente observándose más variación dentro de los grupos característicos de los autosomas. Las principales diferencias observadas se localizan en el its-1 presentando las secuencias específicas del b mayor tamaño debido a varias inserciones ricas en gc. Los 4 tipos de secuencias definidos pertenecen a genes ribosómico funcionales, lo que queda corroborado por la presencia de nucleolo asociado tanto al cromosoma x como al b en individuos de la población de torrox. los genes para las histonas son genes que se transcriben y se traducen a proteínas por lo que en este caso es interesante realizar un estudio de secuencias tanto a nivel de adn como de proteína. Actualmente estamos llevando a cabo el análisis bioinformático de los datos de secuencias obtenido para cada una de las histonas, que se completará con los datos de secuencia obtenidos para el espaciador que separa ambas histonas. la comparación de todas estas secuencias amplificadas en los cromosoma b y x nos permitirán profundizar en la evolución de estos cromosomas y nos puede dar una idea más clara del origen del cromosoma b en e. Plorans. el patrón de acetilación de la histona h3 observado a lo largo de la meiosis en los cromosomas b y en la heterocromatina centromérica parece indicar que se trata de una estrategia general para el silenciamiento de la heterocromatina constitutiva (cabrero y col, 2007). el efecto de estos cromosomas sobre los individuos portadores parece estar asociados al estrés que estos cromosomas producen sobre los individuos hospedador, ya que tanto los niveles de expresión de la hsp70 como los niveles de expresión de los genes ribosómicos, medido por el área nucleolar, se encuentran influenciados por la presencia de estos cromosomas b. además, en la población de torrox, donde la frecuencia de cromosomas b es muy alta, se ha observado recientemente la expresión de los genes ribosómicos que portan los cromosomas b (teruel y col, 2007). Hasta entonces no se tenía constancia de dicha actividad en esta especie, excepto para un único macho que presentaba una traslocación entre el cromosoma b y uno de los autosomas (cabrero et al, 1987). Los cromosoma b de e. Plorans presentan una alta tasa de mutación habiéndose descrito multitud de variantes polimórficas. Recientemente hemos observado la aparición de nuevas variantes de cromosoma b en esta población, por lo que es posible que haya aparecido una nueva variante capaz de expresar los genes ribosómico y conferirles a los individuos portadores algún efecto beneficioso. el saltamontes e. Plorans es una de la especies cuyo sistema de cromosomas b esta mejor estudiado (camacho et al, 2000). Los datos obtenidos durante el desarrollo de este proyecto aclaran aspectos relacionados con la naturaleza y evolución molecular de estos cromosomas y con la expresión génica y el efecto de estos sobre los individuos portadores.
Datos académicos de la tesis doctoral «Origen, expresión y efectos fenotípicos de un parásito genómico«
- Título de la tesis: Origen, expresión y efectos fenotípicos de un parásito genómico
- Autor: María Teruel Artacho
- Universidad: Granada
- Fecha de lectura de la tesis: 06/03/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Josefa Cabrero Hurtado
- Tribunal
- Presidente del tribunal: eduard Petitpierre vall
- Juan José Pasantes ludeña (vocal)
- María Jesús Puertas gallego (vocal)
- José María Corral garcia (vocal)