Tesis doctoral de David Calzada Ricote
Analizar la respuesta específica de células mononucleares de sangre periférica (pbmc), en 5 grupos clínicos relacionados con la alergia al polen de olivo, frente al extracto completo del polen (olea) y el potencial terapéutico in vitro de péptidos derivados del alérgeno principal, ole e 1, con el fin de definir mecanismos inmunológicos reguladores implicados y nuevas dianas terapéuticas. Materiales y métodos: se seleccionaron 84 sujetos clasificados clínicamente en 5 grupos: g1. No alérgicos, g2. Asintomáticos (con reacciones cutáneas positivas frente al extracto de polen de olivo), g3. Alérgicos no sensibilizados al polen de olivo, g4. Alérgicos al polen de olivo sin tratamiento, g5. Alérgicos al polen de olivo tratados con inmunoterapia específica, de los que se obtuvieron suero, para cuantificar los niveles de ige total y específica frente al extracto completo del polen de olivo, y pbmc, durante y fuera del periodo de polinización. Las pbmc se cultivaron durante 24 horas en ausencia (condición basal) o presencia de los estímulos olea o péptidos derivados de ole e 1. Por un lado, los péptidos reconocidos como posibles epítopos inmunomoduladores, aminoácidos (aa)11-33 de la secuencia, denominado péptido 2+3. Por otro, los péptidos definidos previamente como epítopos inmunodominantes, (aa91-102, 109-120, 119-130, denominado péptido 10+12+13). Tras el cultivo celular, se realizaron 2 tipos de análisis: en el sobrenadante del cultivo se estudiaron los cambios de secreción de citocinas tras la estimulación. Se analizaron los niveles de il2, infg, il4, il5, il13, il10, tgfb y tnfa, mediante citometría de flujo y elisa. Por otro lado, se extrajo el rna del pellet celular, para evaluar los cambios de expresión génica a nivel global inducido por los estímulos utilizando el microarray ¿affymetrix hgu133 plus 2.0¿. Se analizaron más exhaustivamente las muestras recogidas fuera del periodo de polinización para el grupo de pacientes alérgicos al polen de olivo sin tratamiento, validándose los resultados obtenidos para 189 genes mediante qrtpcr. Finalmente, se estudió la modulación de la respuesta proliferativa frente a olea con estos péptidos. Resultados: en la caracterización humoral, los sujetos asintomáticos mostraron los mayores niveles de ige total, mientras que los niveles más altos de anticuerpos ige específicos se observaron en los sujetos alérgicos al polen de olivo (con o sin inmunoterapia). No se pudo establecer un patrón diferencial de secreción de citocinas entre los cinco grupos clínicos en las muestras sin estimular pero sí a nivel de expresión génica, como mostró el análisis de componentes principales (pca) que las agrupó en 5 grupos, coincidentes con los establecidos clínicamente. Analizando la influencia de los estímulos y el periodo de recogida de las muestras, los resultados más relevantes se obtuvieron comparando el grupo de sujetos no alérgicos y alérgicos al polen de olivo sin tratamiento. Los estímulos modificaron la secreción de las citocinas reguladoras (il10, tgfb), de modo distinto según el periodo de estudio. Respecto a la expresión génica, el pca mostró cómo los estímulos modificaban esta expresión de forma específica en las muestras del grupo de los alérgicos pero no en el de los sujetos no alérgicos. La validación de los resultados de expresión génica en los sujetos alérgicos al polen de olivo sin tratamiento mediante qrtpcr, definió un patrón diferencial de 51 genes específicamente modulados por el péptido 2+3. Muchos de estos genes están implicados en la regulación del sistema inmunitario, por lo tanto con potencial uso en terapia. Los ensayos de proliferación e inhibición de pbmc demostraron que el péptido 2+3 es capaz de inhibir significativamente la respuesta específica frente a olea. conclusión: el péptido 2+3 podría ser un buen candidato a tener en cuenta para la mejora del tratamiento en la alergia al polen de olivo.
Datos académicos de la tesis doctoral «Alergia al polen de olivo: potencial terapeutico de péptidos definidos a partir de su alérgeno principal, ole e 1«
- Título de la tesis: Alergia al polen de olivo: potencial terapeutico de péptidos definidos a partir de su alérgeno principal, ole e 1
- Autor: David Calzada Ricote
- Universidad: Complutense de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 16/06/2015
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Blanca Cardaba Olombrada
- Tribunal
- Presidente del tribunal: María teresa Villalba diaz
- Santiago Quirce gancedo (vocal)
- joaquín Sastre domínguez (vocal)
- domingo Barber hernández (vocal)