Tesis doctoral de Elena Carneros García
El pino piñonero (pinus pinea l.) Es una de las especies arbóreas más características de la flora mediterránea, con gran importancia ecológica, social y económica. Debido a su rusticidad y porte aparasolado puede considerarse como especie destinada a usos paisajísticos y recreativos, pero su aprovechamiento principal es el fruto (piñones comestibles), siendo españa uno de los países con mayor producción. La mejora genética de esta especie va orientada fundamentalmente a una utilización agronómica y requiere la identificación de individuos buenos productores de piña y piñón. El pino piñonero se muestra recalcitrante en su capacidad morfogénica, por lo que es necesario desarrollar técnicas de propagación vegetativa eficaces que permitan la mejora de esta especie. la embriogénesis somática es un proceso in vitro que incluye el desarrollo de masas embriogénicas en embriones bipolares capaces de madurar, germinar y aclimatarse a condiciones ex vitro. Hoy se considera como la vía más adecuada para la micropropagación clonal de especies forestales, alcanzándose recientemente grandes progresos en las coníferas. Este trabajo se ha centrado en el estudio de determinados aspectos de la embriogénesis somática, utilizada como vía para la regeneración clonal de árboles selectos de pino piñonero, siendo la primera vez que se ha abordado esta técnica de micropropagación en esta especie. La memoria de tesis se ha dividido en varios capítulos, que se corresponden con las sucesivas fases del proceso: inducción de la respuesta embriogénica, proliferación y mantenimiento del material embriogénico inducido, maduración de los embriones somáticos, germinación y conversión de los embriones en plantas. Además se ha evaluado el efecto de la crioconservación sobre la recuperación del crecimiento de distintas líneas embriogénicas. se ha estudiado la respuesta embriogénica de diferentes tipos de explantos, tanto embrionarios (embriones cigóticos maduros e inmaduros) como no embrionarios (estróbilos femeninos, estróbilos masculinos, acículas en expansión, yemas y hojas de inserción aislada). Para ello se han ensayado distintas condiciones de inducción, donde se ha evaluado la influencia de factores como el genotipo, la composición del medio nutritivo, y tipos y niveles de reguladores del crecimiento. únicamente se ha conseguido la respuesta embriogénica a partir de explantos embrionarios, aunque con los no embrionarios se han obtenido respuestas prometedoras. Las mayores frecuencias de inducción se han obtenido con los embriones cigóticos inmaduros. El protocolo de inducción se ha basado en el cultivo de megagametofitos completos, la aplicación de los reguladores del crecimiento 2,4-d (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) y bap (6-bencilaminopurina), y un aporte de nitrógeno orgánico. El tejido embriogénico aparece en forma de extrusión en el extremo del micropilo del megagametofito. La proliferación del material embriogénico se ha llevado a cabo en el medio de inducción modificado, manteniéndose ésta capacidad proliferativa con el tiempo, siendo su potencial multiplicativo muy alto. Para el mantenimiento de las líneas embriogénicas se han realizado subcultivos bisemanales a medio de cultivo fresco. La diferenciación de los embriones somáticos ha requerido un precultivo de las masas embriogénicas en medio con los nutrientes reducidos y bajas concentraciones de reguladores; posteriormente, las masas se han disgregado en medio con carbón activo, cultivándose en presencia de aba (ácido abscísico) y alto contenido osmótico. La desecación parcial de las masas embriogénicas ha favorecido la maduración. Cuando los embriones alcanzan el estado cotiledonar se ha procedido a su germinación, y a la transferencia a condiciones ex vitro de las plantas somáticas para su aclimatación. las frecuencias de iniciación de tejido embriogénico en el pino piñonero han sido relativamente bajas, pero similares a las obtenidas inicialmente en otras especies del género pinus. Se sugiere la existencia de una ventana en el desarrollo del embrión cigótico más sensible a la inducción, pues las mayores respuestas se han obtenido cuando el embrión se encontraba entre el estado de poliembrionía de partición y el estado cotiledonar inicial. El medio de cultivo y los reguladores del crecimiento también han influido en las frecuencias de iniciación, obteniéndose los mejores resultados con el medio litvay modificado, suplementado con l-glutamina e hidrolizado de caseína y la combinación de 9 m de 2,4-d y 4,5m de bap. Se ha observado una fuerte influencia del genotipo en las fases de inducción, proliferación y maduración de los embriones somáticos. La maduración de los embriones somáticos se ha visto afectada por la elevada de proliferación de los cultivos, no obstante se han obtenido tasas de maduración similares a las de otras especies de pinos. La germinación de los embriones somáticos se ha mejorado realizando un tratamiento pregerminativo de los cultivos en frío. La germinación de los embriones se ha visto influída por su posición en los medios de cultivo, obteniéndose mayores frecuencias cuando se disponen en las placas en posición horizontal y éstas se inclinan 40º. El desarrollo de las plántulas se ha estimulado modificando el medio de cultivo y la intensidad luminosa. Se ha logrado la regeneración de plantas a partir de los embriones germinados, a través de la optimización de las fases de maduración y germinación. se ha desarrollado un protocolo de crioconservación de líneas embriogénicas de pino piñonero, lo que evitaría la pérdida de vigor y capacidad morfogénica de las masas embriogénicas por el cultivo prolongado. Se ha evaluado la influencia de los agentes crioprotectores (sorbitol y dmso) en la viabilidad del material embriogénico, observándose un cierto grado de toxicidad que revierte con los subcultivos además de la influencia del genotipo en la respuesta. La recuperación del crecimiento de las líneas embriogénicas crioconservadas pasa por una fase de latencia, igualándose al crecimiento de las líneas no crioconservadas con los subcultivos. La mezcla de 0,4 m de sorbitol y 15 % de dmso ha proporcionado la mayor tasa de recuperación. Ha sido posible la maduración y germinación de los embriones somáticos procedentes del material crioconservado, obteniéndose embriones capaces de convertirse en plantas.
Datos académicos de la tesis doctoral «Embriogénesis somática en pino piñonero (pinus pinea l.)«
- Título de la tesis: Embriogénesis somática en pino piñonero (pinus pinea l.)
- Autor: Elena Carneros García
- Universidad: Alcalá
- Fecha de lectura de la tesis: 11/05/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Cristina Celestino Mur
- Tribunal
- Presidente del tribunal: nicolas Jouve de la barreda
- isabel Arrillaga mateos (vocal)
- Luis alfonso Gil sánchez (vocal)
- Jesús Alegre alvaro (vocal)