Tesis doctoral de Sheyla González Garrido
La derivación de líneas de células madre embrionarias (escs) depende de todo un conjunto de factores relacionados tanto con el embrión como con el propio proceso de derivación, cuyo conocimiento es de gran importancia para incrementar la eficiencia de establecimiento de estas líneas. Las escs de ratón (mescs), en concreto, representan un modelo de especial relevancia en ciencia básica para optimizar y estandarizar unos protocolos de derivación que produzcan una eficiencia de derivación razonable y conduzcan a la obtención de líneas de escs de calidad en relación a su pluripotencialidad y estabilidad durante el cultivo in vitro. La presente tesis doctoral pretende estudiar algunos de los parámetros que podrían ser importantes durante el proceso de derivación de mescs a partir de blastómeros aislados de los estadios embrionarios de 4 y 8 células. La derivación a partir de blastómeros aislados representa un avance importante para evitar la destrucción de embriones, un aspecto especialmente importante en el caso de los embriones humanos de cara a un posible tratamiento de medicina regenerativa. en la primera parte del diseño experimental, se ha analizado la influencia del método de derivación, el número de blastómeros aislados y estadio embrionario, en la eficiencia de establecimiento de líneas de mescs. Los resultados obtenidos a partir de la comparación de tres métodos de derivación de mescs indicaron que la eficiencia de establecimiento es más elevada cuando la derivación se produce en un medio de cultivo definido sin suero evitando, así, la diferenciación espontánea de las mescs. Además, se determinó que la adhesión previa al sustrato de los blastómeros o embriones a partir de los cuales se inicia la derivación no incrementa la eficiencia del proceso, sinó que el contacto inicial con las células de soporte en co-cultivo es crucial. Por lo que respecta a la influencia del número de blastómeros aislados, tanto en estadio de 4 como 8 células, el rendimiento del proceso de establecimiento incrementa utilizando un mayor número de blastómeros aislados, de modo que la máxima eficiencia se produce cuando se utiliza la mitad del embrión como máximo para no comprometer la viabilidad del mismo. Finalmente, los estadios embrionarios que aportaron una mayor eficiencia de derivación de líneas de mescs fueron los estadios posteriores a la compactación (mórula y blastocisto). No se encontraron diferencias entre los estadios de 4 y 8 células, aunque la tendencia apuntaba a un aumento en la eficiencia a partir de embriones en estadio de 8 células. recientemente, se ha determinado la importancia de las uniones adherentes de e-cadherina en la derivación y el mantenimiento de líneas de mescs y también de líneas humanas (hescs). En este sentido, en una segunda parte de la experimental se estudió la importancia de este tipo de unión tanto en la proliferación como en el inicio del proceso de derivación de líneas de mescs a partir de blastómeros únicos aislados en estadio de 8 células (grupo 1/8). Con este objetivo se unió una proteína quimérica formada por el dominio extracelular de la e-cadherina y el dominio fc de la igg1 humana (e-cad-fc) en la superficie de los blastómeros del grupo de 1/8. Esta proteína quimérica se cree que desencadena una cascada de señalización similar a la que se produciría cuando dos o más blastómeros contactan a través de uniones con e-cadherina nativa, lo que se traduce en un incremento en la tasa de división de los blastómeros individuales y en la eficiencia de derivación de mescs después de una exposición de 24 h. El efecto en la eficiencia de derivación podría ser consecuencia de la distribución uniforme que adopta la e-cad-fc en la superficie de los blastómeros y que determinaría que éstos tuvieran una predeterminación a formar parte de la masa celular interna ( icm) del blastocisto, a partir de la cual se derivan las líneas de mescs. finalmente, dado que existen evidencias moleculares y citológicas que indican que los blastómeros podrían tener su localización en la icm o el trofectodermo (te) del blastocisto prefijada ya en estadios embrionarios tempranos, el aislamiento de un blastómero concreto del embrión con un destino preferencial a formar parte de la icm podría incrementar la eficiencia del proceso de derivación. En una etapa final de la experimental, se intentó determinar si el aislamiento de blastómeros concretos en estadio de 4 células produce eficiencias de derivación diferentes en función de la temporalidad y la orientación de los planos de división que se establecen en estadio de 2 células. A partir de experimentos de seguimiento de los blastómeros a lo largo de las divisiones embrionarias hasta el estadio de blastocisto con un colorante lipofílico determinamos que los blastómeros procedentes de la primera división en sentido ecuatorial tendían a formar parte del te del blastocisto. En cambio, no se encontró una tendencia clara para los blastómeros procedentes de la primera división en estadio de 2 células en sentido meridional, a pesar de que un porcentaje mayor de los descendientes de estos blastómeros se localizaban en la icm del blastocisto. Los experimentos de derivación de líneas de mescs, en cambio, mostraron eficiencias de derivación similares para todos los grupos estudiados, independientemente de si estos blastómeros en el embrión mostraban una predeterminación concreta. Se sabe que el aislamiento de blastómeros puede producir un redireccionamiento en el destino de los mismos, de manera que todos ellos tendrían las mismas posibilidades de formar una línea de mescs, lo que podría explicar los resultados encontrados en nuestro estudio. mediante el análisis de estos factores, y combinando las condiciones descritas por otros autores y algunas de las aproximaciones descritas en la propia tesis doctoral, hemos determinado cuáles son las condiciones óptimas que aportan un incremento de la eficiencia de derivación de las líneas de mescs a partir de blastómeros aislados de los estadios embrionarios de 4 y 8 células.
Datos académicos de la tesis doctoral «AnÁ lisi de parÁ metres que influeixen en la derivació de línies de cél·lules mare embrionÁ ries de ratolí a partir de blastómers aÁ¯llats«
- Título de la tesis: AnÁ lisi de parÁ metres que influeixen en la derivació de línies de cél·lules mare embrionÁ ries de ratolí a partir de blastómers aÁ¯llats
- Autor: Sheyla González Garrido
- Universidad: Autónoma de barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 05/04/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Mª Elena Ibáñez De Sans
- Tribunal
- Presidente del tribunal: anna Veiga lluch
- begoña Aran corbella (vocal)
- (vocal)
- (vocal)