Tesis doctoral de Raquel Sarmiento Mañús
Esta tesis es parte de la disección genética y molecular del desarrollo de las hojas de las plantas que se está llevando a cabo en el laboratorio de j.L. Micol. Hemos caracterizado 11 mutantes, portadores de alelos de 6 genes nucleares de arabidopsis thaliana, que manifiestan alteraciones en el mesófilo o la epidermis foliar. Al menos 4 de estos genes codifican proteínas que actúan en el cloroplasto, y todos parecen relacionados en mayor o menor medida con el intercambio de señales entre el núcleo y el cloroplasto. las hojas de los mutantes venosa (ven) son reticuladas: sus venas son verdes y destacan sobre un limbo pálido, un rasgo morfológico externo que suele indicar un desarrollo insuficiente de los tejidos internos. Nos interesamos inicialmente por los genes ven porque les consideramos presuntamente implicados en el desarrollo del mesófilo. hemos estudiado 4 alelos del gen ven4. El fenotipo mutante de ven4-2 es más extremo que el de ven4-1, siendo ven4-3 y ven4-4 los alelos más débiles. Los mutantes ven4-1 y ven4-2 sufren una reducción en el área de la roseta y el limbo foliar, y en su peso fresco y seco, así como en el tamaño, aunque no el número, de las células del mesófilo en empalizada. Hemos clonado posicionalmente el gen ven4, que codifica una presunta fosfohidrolasa de función desconocida y se expresa en las hojas y las flores incipientes, la raíz y el tallo. La proteína ven4 es nuclear. la mutación dov1 (differential development of vascular associated cells1) causa reticulación foliar. Hemos clonado posicionalmente el gen dov1, que codifica la glutamina fosforribosil pirofosfato amidotransferasa 2, que cataliza la primera reacción de la síntesis de novo de las purinas. Hemos obtenido dobles mutantes cuyos fenotipos indican la epistasia de scabra3 (sca3; codifica una polimerasa de arn que transcribe los genes del cloroplasto) sobre ven4 y la sinergia entre este último y dov1. El estudio de la relación funcional entre dov1 y sca3, que actúan en el cloroplasto, y ven4, que lo hace en el núcleo, podría aportar información acerca de la señalización intracelular. la mutación puntual ven6-1 causa una reducción en el peso fresco y seco de la planta, y un aumento en el tamaño de los espacios intercelulares del mesófilo en empalizada. Hemos identificado un alelo insercional y presuntamente nulo de ven6 (ven6-2). La clonación posicional de ven6 ha revelado que codifica la subunidad pequeña de la carbamoil fosfato sintetasa (cps), que cataliza en otras especies la conversión de glutamina en glutamato y carbamoil fosfato (cp). El cp se condensa con la ornitina para rendir citrulina en la primera etapa de la ruta de biosíntesis de la arginina. Hemos llevado a cabo un análisis metabolómico que ha demostrado que ven6-1 acumula ornitina. La adición de citrulina al medio de cultivo suprime el fenotipo mutante de ven6-1, y la de ornitina le resulta más tóxica que a su ancestro silvestre. Nuestros resultados indican que la actividad cps y la arginina son necesarias para el desarrollo del mesófilo intervenal, pero no para las venas y las células perivasculares, en las hojas de arabidopsis. La expresión heteróloga del gen ven6 en mutantes de escherichia coli deficientes en la actividad cps nos ha permitido demostrar su actividad enzimática, así como que su función está conservada entre estas dos especies tan distantes. la superficie del limbo de los mutantes rugosa (rug) es irregular, lo que a primera vista sugiere que están afectados en genes implicados en el desarrollo de la epidermis foliar. Además, en el limbo de los mutantes rug2 se alternan los sectores pigmentados y despigmentados, mientras que los rug1 presentan zonas necróticas, observaciones que sugieren la alteración de los tejidos internos. hemos encontrado en los sectores verdes de las hojas de los mutantes rug2 un aumento en el número de células del mesófilo en empalizada y una reducción en su tamaño. Las células pavimentosas de la epidermis adaxial son más numerosas y pequeñas en rug2-2 que en el tipo silvestre. La proteína rug2 es homóloga de los factores de terminación de la transcripción mitocondrial de los metazoos, y se localiza tanto en las mitocondrias como en los cloroplastos. La transcripción de los genes mitocondriales disminuye y la de los cloroplásticos aumenta en el mutante rug2-1. Nuestros resultados indican que rug2 es un componente de la regulación anterógrada de la mitocondria y el cloroplasto por el núcleo, y que participa en el control de la transcripción del genoma de al menos uno de estos orgánulos. Hemos obtenido dobles homocigotos para alelos de insuficiencia de función de rug2 y su parálogo más cercano, al que hemos llamado rug3, cuyo fenotipo ha resultado ser sinérgico y letal, lo que sugiere que estos dos genes son funcionalmente redundantes. las hojas del mutante rug1 presentan sectores necróticos en los que hemos detectado h2o2, rasgos fenotípicos que se extreman cuando es cultivado en condiciones de día largo. Rug1 codifica una presunta porfobilinógeno desaminasa (cataliza la quinta etapa de la ruta de biosíntesis de los tetrapirroles) y su epistasia sobre lin2 (lesion initiation2; codifica la coproporfirinógeno iii oxidasa, que cataliza la octava etapa de la ruta). Rug1 podría ser útil para el estudio de la señalización retrógrada, en la que se ha propuesto que participan los tetrapirroles. El análisis de este mutante también resultará de utilidad para la comprensión de los mecanismos de defensa de las plantas contra el estrés fotooxidativo.
Datos académicos de la tesis doctoral «Análisis genético de mutantes variegados en arabidopsis thaliana«
- Título de la tesis: Análisis genético de mutantes variegados en arabidopsis thaliana
- Autor: Raquel Sarmiento Mañús
- Universidad: Miguel hernández de elche
- Fecha de lectura de la tesis: 15/04/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- José Luis Micol Molina
- Tribunal
- Presidente del tribunal: vicente Moreno ferrero
- Manuel Piñeiro galvin (vocal)
- francisca Sevilla valenzuela (vocal)
- monserrat Elias arnanz (vocal)