Tesis doctoral de Martín González Riopedre
Introducción las quinasas las quinasas son enzimas fosforilantes que catalizan la adición de un grupo fosfato procedente de atp u otro nucleósido trifosfato al grupo hidroxilo de un aminoácido de la proteína sustrato, generando la formación de un enlace fosfoéster. pueden actuar sobre glúcidos, lípidos o proteínas. Si actúan sobre proteínas podemos distinguir dos tipos de proteínas quinasas: pks de serina – treonina que fosforilan residuos serinas o treoninas (como la pka o la pkc), y pks de tirosina que actúan sobre residuos tirosina como la familia de las src quinasas. proteína quinasa c existen numerosas referencias en la bibliografía otorgando a esta proteína un papel central en la transducción de señales en la célula. Así, se ha implicado a la pkc en la regulación del crecimiento y diferenciación celular, desarrollo neural, transmisión sináptica, regeneración axonal, contracción y relajación del músculo liso, secreción endocrina y exocrina, desarrollo de tumores, apoptosis y envejecimiento. Se pensaba que la pkc residía en el citoplasma en una conformación inactiva y que se translocaba a la membrana plasmática o a los orgánulos citoplasmáticos debido a la activación celular por diferentes estímulos. Sin embargo, las evidencias recogidas durante los últimos 20 años han mostrado que la pkc es capaz de translocarse al núcleo. se han descrito hasta el momento once isotipos de pkc diferentes, cada isotipo tiene un rol distinto. Las pkcs pueden clasificarse en tres grandes grupos: a) las clásicas o dependientes de calcio (cpkcs): ¿, íYi, íYii y ¿. son sensibles al ca2+, dag y son activadas por ésteres de forbol, clásicamente forbol 12 – miristato 13 – acetato (pma) y fosfatidilserina (ps). b) las nuevas o independientes de calcio (npkcs): ¿, ¿, ¿ y ¿. son independientes de ca2+ (carecen de región c2) pero son activadas por ésteres de forbol, fosfatidil serina y diacilglicerol. c) las atípicas, (apkcs): ¿, ¿, ¿. estas son independientes de ca2+ (carecen de la región c2) y no son sensibles a los ésteres de forbol, dag y pma, son dependientes de ps y estos isotipos tienen tan solo una secuencia rica en cisteina en la región c1. adicionalmente, pkc ¿ y ¿ son considerados por algunos una cuarta clase y para otros comprenden una familia distinta llamada proteína quinasa d. Todos los miembros tienen en común un dominio catalítico conservado en la región carboxilo terminal. La otra mitad de la quinasa, el dominio regulador presenta 2 partes clave: una secuencia autoinhibidora (pseudo-sustrato) y uno o dos módulos de unión a la membrana (dominios c1 y c2) y, en el caso de la proteína quinasa d, el dominio ph. estructura de las pkcs todas las isoformas de pkc están formadas por una cadena polipeptídica, en la que se detectan regiones conservadas (c1-c4) separadas por regiones variables (v1-v5). La región carboxilo-terminal que comprende las regiones c3-v5, ha sido definida como el dominio catalítico, el cual está separado del dominio regulador amino-terminal por la región v3. el dominio catalítico contiene secuencias consenso para la unión de atp (región c3), la región de transferencia del fosfato y el sitio de unión del sustrato (región c4). el dominio regulador contiene varias regiones que permiten la interacción de la proteína con lípidos y los cofactores necesarios para su activación. La región v1 contiene una secuencia considerada como un pseudosustrato que es muy similar a secuencias de fosforilación para pkcs, excepto porque el residuo diana de serina/treonina está sustituido por un aminoácido no fosforilable, generalmente alanina. distribución tisular de la pkc se ha determinado mediante análisis por northern o western blot la distribución de las isoenzimas pkc (esta distribución aparece resumida en la tabla 1.1). Las pkc ¿, íYi, íYii, ¿, ¿ y ¿ parecen ser isoenzimas ubicuas que aparecen en la mayoría de los tejidos, mientras que la expresión de otras pkcs es en gran parte específica del tipo de célula. los tejidos están constituidos por distintos tipos celulares, por tanto, es importante determinar qué isoenzimas están presentes en cada uno de ellos. De igual forma, es interesante establecer el perfil de las isoformas en los cultivos celulares, puesto que pueden existir diferencias entre las células cultivadas y el tipo celular de procedencia. En general, las diferentes isoformas de pkc tienen patrones de distribución específicos en la célula, que reflejan los diferentes papeles de cada isoforma. distribución subcelular de la pkc las formas inactivas de la pkc se encuentran mayoritariamente en el citosol, mientras que sus activadores, de naturaleza hidrofóbica, están presentes en la membrana. recientemente, se han realizado estudios con técnicas de microscopía confocal, que revelan una localización más compleja y específica de las diferentes isoenzimas de la pkc. Estos estudios demuestran que en células que expresan varias isoformas, la mayoría de ellas se encuentran localizadas en estructuras subcelulares y, tras la activación, mudan su localización a diferentes localizaciones en la célula. Las isoformas de pkc ¿, íY y ¿ se localizan principalmente en la fracción citosólica de células no estimuladas y experimentan una translocación a las membranas celulares de células activadas. activación de pkc para las cpkcs, el modelo de activación intracelular, aceptado actualmente, sería el siguiente: 1) la activación de la plc gamma produciría la hidrólisis de fosfatidilinositol 4,5 – bifosfato (pip2), asociado a la membrana, liberándose dag e ip3. 2) el ip3 producido provocaría la liberación de calcio de reservas intracelulares no mitocondriales. 3) el calcio liberado se uniría a la región c2 de la pkc produciendo la translocación de la enzima a la membrana plasmática. 4) una vez en la membrana plasmática, la pkc se uniría a través de la región c1 al dag, generado anteriormente y a ps, que está constitutivamente presente en la membrana, produciéndose su activación. translocación una particularidad importante en la activación de pkc es la redistribución intracelular de la enzima. La pkc ha sido localizada en la fracción citosólica de las células y la activación de esta quinasa está asociada a una redistribución de la enzima desde el citosol hacia ambientes más hidrofóbicos como puede ser la membrana plasmática. La unión de ca2+ y dag a esta quinasa en presencia de fosfatidil l-serina (ps), provoca un cambio conformacional en la pkc, incrementándose de esta forma, su hidrofobicidad. La dinámica del movimiento de la quinasa a la membrana plasmática, en respuesta a la activación de receptores de superficie celular, ocurre en tres pasos: la translocación a la membrana, el anclaje y la disociación. Se sabe que estos procesos son regulados por autofosforilaciones, aunque la quinasa se fosforile en el citosol, necesita de varias fosforilaciones para alcanzar la membrana, aún en presencia de calcio. Las fosforilaciones inciden en el aumento de la afinidad por dag y ps. Finalmente, una vez cesada la estimulación sobre el receptor de superficie, se produce la disociación de la pkc, por un descenso de los niveles de dag y ca2+, que inducen una autofosforilación de los dominios reguladores. proteolisis de pkc la pkc fue descubierta como una proteína quinasa activada por proteasas, aunque posteriormente se vio que la proteolisis seguía a la activación. Se piensa que las proteasas responsables, «in vivo», son las proteasas neutras dependientes de calcio (calpainas i y ii). La activación proteolítica se puede realizar «in vitro» mediante tratamiento limitado con tripsina aunque «in vivo» se piensa que la activación y translocación a la membrana celular son requisitos previos a la proteolisis. No está claro si la degradación proteolítica sirve como mecanismo para inactivar la quinasa o si el fragmento catalítico liberado de la membrana o del citosol (y posiblemente de otros compartimentos celulares), es capaz de actuar como una quinasa con actividad constitutiva independiente de activadores. down regulation otro mecanismo importante dentro de los procesos de regulación es la «down regulation». Se denomina «down regulation» al fenómeno por el que se depleciona la pkc, por degradación proteolítica, como consecuencia por ejemplo del tratamiento prolongado de determinados tipos celulares con ésteres de forbol. Con respecto a la «down regulation», las distintas isoenzimas de pkc muestran rasgos muy diferentes que están de acuerdo con los observados in vitro. regulación de la pkc la proteína quinasa c es regulada por dos mecanismos secuenciales e igualmente críticos: fosforilación provocada por la pdk-1, y unión a dag y/o otros cofactores. Cada mecanismo regula la estructura, localización subcelular y función de la pkc. las pkcs recién sintetizadas se asocian a un compartimento de membrana en la célula y en una conformación «abierta» en la que la secuencia auto-inhibitoria del pseudo-sustrato es expulsada del sitio activo del dominio catalítico. La pdk-1 se acopla al c-terminal expuesto y el sitio de la pdk-1 en la secuencia del asa de activación queda accesible para su fosforilación. Tras la fosforilación de la secuencia del asa de activación, pdk-1 es liberada del c-terminal de la pkc, y éste queda expuesto para sufrir dos fosforilaciones rápidas. En el caso de pkcs convencionales, esta fosforilación ocurre por un mecanismo intramolecular de auto-fosforilación. Las especies fosforiladas (maduras) son liberadas al citosol y el pseudosustrato puede acceder al sitio activo, manteniendo la enzima en un estado autoinhibido. La enzima es activada tras la generación de calcio y diacilglicerol mediada por receptores. Estos ligandos reclutan la pkc de la membrana mediante la participación de dos módulos de anclaje en la membrana, un suceso que proporciona la energía necesaria para expulsar al pseudosustrato de la cavidad de unión del sustrato y permite la fosforilación del sustrato. proteínas de anclaje de las pkc las proteínas que interactúan con isoformas específicas de pkc para la localización en los compartimentos especializados de la célula son llamadas proteínas de anclaje (o de corte). las proteínas de anclaje para las isoenzimas de la pkc activas se han denominado como receptores para quinasa c activas (rack). Rack1, que fue la primera proteína de anclaje en ser aislada para pkc íYii reveló la unión de varias isoformas de pkc inclusive pkc ¿ y pkc ¿. mochly-rosen y gordon (1998) han propuesto la existencia de otro grupo de proteínas de anclaje para las formas inactivas de la pkc que han sido denominadas receptores para quinasa c inactivas (rick). ricks se han identificado proteínas adicionales de unión a la pkc, todas ellas son sustrato de la pkc y unen directamente ps. La unión de ps es común en este tipo de proteínas de unión, la cual parece actuar de puente entre la pkc y dichas proteínas. Entre éstas se incluyen la talina, la vinculina, sustrato de la quinasa c rico en alanina miristoilada (marck), akap79, y algunas otras. entre algunas de las características predichas para estas rick se encuentran las siguientes: no necesariamente son sustratos de la pkc, deben demostrar preferencia de unión por formas inactivas de este enzima y, finalmente, los ésteres de forbol u otros activadores de la pkc deben inducir la separación del complejo rick/pkc. racks estas proteínas están presentes en la fracción celular particulada y unen la quinasa c activa de forma selectiva y saturable. En estos casos, un puente de ps parece no ser suficiente para establecer la unión, sino que se requieren interacciones proteína-proteína directas. Otra propiedad de esta interacción es que la unión de la pkc al rack no está inhibida por péptidos sustrato, indicando que el anclaje no se produce en el lugar catalítico o lugares de fosforilación de la pkc. sustratos de pkc sustratos de pkc «in vitro» durante cierto tiempo se observó que, al menos, «in vitro» las cpkcs eran serina / treonina quinasas no específicas. Por tanto, cualquier proteína básica, como histona hi, hiiis, proteína básica de mielina (mbp), protamina u otros péptidos podrían utilizarse como sustratos, siempre y cuando tuvieran la secuencia xrxxs/txrx; siendo este rasgo muy distinto de la especificad de sustrato que presentaban muchas de las quinasas estudiadas hasta entonces. Sin embargo, una comparación de las isoenzimas de pkc y sus actividades hacia distintos sustratos, «in vitro», ha mostrado diferencias que pueden indicar una cierta especificad hacia los sustratos naturales bajo condiciones fisiológicas. sustratos de pkc «in vivo» en cuanto a los sustratos de pkc in vivo resaltar que: mediante el marcaje de células con 32p y estimulación de las mismas con ésteres de forbol u otros agonistas que estimulan la pkc, se han descubierto muchos posibles sustratos fisiológicos. hay tres sustratos importantes en el control de la proliferación celular: a) marks su fosforilación lleva a una redistribución de los filamentos de actina desde la membrana al citoplasma; b) y c) dna topoisomerasa y lamina b, que son proteínas nucleares implicadas en el control de la síntesis de dna, y que darían relevancia a la translocación de la pkc al núcleo. las proteínas marcks (sustratos de la quinasa c ricos en alanina miristoilada) y proteínas relacionadas con marcks (mrp) están distribuidas extensamente como proteínas unidas a las membranas, son los principales sustratos de las pkcs y están implicadas en la propagación de las células, la activación de la integrina y la exocitosis. Marcks, se une a la f-actina y puede funcionar como un puente cruzado entre la actina del citoesqueleto y la membrana plasmática. su importancia es debida al hallazgo de que marcks están implicadas directamente en la hipersecreción de mucus que ocurre durante enfermedades tales como el asma, y la bronquitis o fibrosis cística crónicas. inhibidores de pkc se denomina inhibidor a toda sustancia que se une a una enzima y reduce la velocidad de la reacción que cataliza. La inhibición de algunas enzimas por inhibidores específicos constituye un importante sistema de regulación de las reacciones que ocurren en las células y en ciertos casos tiene aplicaciones clínicas. podemos clasificar los inhibidores en dos tipos: inhibidores irreversibles inhibidores irreversibles (inhibidores competitivos, inhibidores no competitivos). según el mecanismo de acción de los inhibidores también podemos clasificarlos en: a) inhibidores de la unión de atp (ej: bisindolilmaleimidas e indolcarbazoles, son derivados de la estaurosporina). b) inhibidores que actúan en la región c1 afectando a la unión de ésteres de forbol / dag (ej: calfostina c, gossipol, etc). c) inhibidores de la interacción pkc-fosfolípido (ej: curcumina, propanolol, dibucaina, etc). d) proteínas que inhiben la pkc (ej: kcip, calciproteínas, etc). e) agentes disruptivos de membrana (ej: etanol, tocoferoles, etc). f) inhibidores químicos y otras drogas [ej: antralina, pb2+, complejos de pt (ii), etc]. pkc en eucariotas inferiores además de en mamíferos, pkc o proteínas relacionadas con la pkc se han encontrado en eucariotas inferiores tales como levaduras en otros organismos como drosophila, caenorhabditis elegans; dictyostelium y oocitos de xenopus laevis. en saccharomyces cerevisiae se han encontrado tres isoformas similares a las pkcs del grupo de las clásicas; estas isoformas fueron activadas por ca2+, ps y dag o pma, utilizando la histona iii-s como sustrato. Por el contrario, ogita y sus colaboradores (1990) aislaron una pkc a partir de s. Cerevisiae, que fue activada por ca2+, ps y dag, pero no por pma. En drosophila se han encontrado tres isoformas de la pkc, dos son similares a las pkcs clásicas de mamíferos y la tercera es homóloga a la pkc ¿. 1.8.1. Pkc en moluscos en moluscos, por clonaje molecular kruger y sus colaboradores (1991) obtuvieron evidencias acerca de la existencia de dos isoformas de pkc en el molusco marino aplysia californica, apl i y apl ii, las cuales se expresan abundantemente en el sistema nervioso. en las neuronas de aplysia, la activación de la pkc está implicada en la modulación neuronal, que incluye la facilitación presináptica entre las neuronas sensoriales y las motoras; un proceso celular que está implicado en la sensibilización o deshabituación. la quinasa apl i es fuertemente activada por los ácidos grasos de configuración cis, pero sólo en presencia de ca2+. Además, funcionalmente apl i es más parecida a las isoformas ¿ y íY de vertebrados que a la isoforma ¿ neural de vertebrados. La quinasa apl ii es ca2+ independiente y se parece a la pkc ¿ de vertebrados. pkc y pka en m. Galloprovincialis en cuanto al mejillón, nuestro grupo de trabajo ha abordado como objetivo durante los ultimos años el estudio de las proteínas quinasas en este molusco. Así se ha purificado una proteína quinasa dependiente de ampc (pka) de manto de m. Galloprovincialis que se ha visto involucrada en la fosforilación de la fosfofructoquinasa-1 (pfk-1) de manto de la misma especie. Además se ha podido correlacionar los índices de actividad quinasa con los niveles de ampc, en el mismo tejido. por otra parte en m. Galloprovincialis (lmk) han sido identificadas en manto, branquias y pie, 3 isoformas de pkc, que fueron reconocidas como pkc ¿, pkc íY y pkc ¿, mediante la utilización de anticuerpos contra las respectivas isoenzimas de mamífero. más recientemente nuestro grupo de trabajo ha purificado y caracterizado bioquímicamente una npkc en el manto de mejillón con un peso molecular de 105 kda, la cual se ha denominado como p105, presenta actividad quinasa dependiente de fosfatidil l-serina y pma e independiente de ca2+. Se comprobó que la p105, estaba presente en manto, branquias, pie, músculo aductor posterior, hepatopráncreas y hemocitos de m. Galloprovincialis. «In vitro», la proteína p105 es capaz de autofosforilarse sin la presencia de cofactores lipídicos, los parámetros cinéticos de esta proteína, la asemejan a una isoforma npkc de mamíferos. el modelo experimental: mytilus galloprovincialis lmk los mejillones del género mytilus se localizan en aguas litorales y sublitorales poco profundas, tanto en litoral abierto como en estuarios de aguas salobres. Preferentemente se asientan en lugares de aguas movidas y viven de forma sésil adheridos por medio del biso a sustratos resistentes, como rocas, guijarros y arenas de mar compactas. El tipo de vida, así como su localización litoral lo exponen a las condiciones típicas de la vida intermareal, en la cual uno de los principales condicionantes es la exposición periódica al aire durante la marea baja. El límite superior de supervivencia de esta zona viene impuesto por la duración del período de exposición al aire y por el grado de humedad disponible durante ese tiempo. los moluscos bivalvos son animales protóstomos celomados, con simetría bilateral y no segmentados. Presentan una concha que se encuentra formada por dos valvas iguales, unidas dorsalmente y entre las cuales se dispone el cuerpo y la cavidad paleal. La musculatura se encuentra adherida a la concha y son los músculos aductores, anterior (maa) y posterior (map), los más destacados. En la cavidad paleal sobresalen las branquias, que además de actuar como órgano respiratorio, colaboran en la alimentación. El aparato digestivo de mytilus consta de boca (rodeada de palpos labiales), esófago estomago e intestino. Rodeando al estómago y parte del intestino se localiza la glándula digestiva o hepatopáncreas. El manto es el principal tejido de reserva del molusco y permanece adherido a la concha por unas fibras musculares que constituyen la línea o seno paleal. El pie es un órgano musculoso, con forma de hoja y comprimido lateralmente, cuyos movimientos se consiguen por una combinación de acciones musculares y de presión hidráulica. inmunidad: sistemas y respuestas inmunitarias el sistema inmune en todos los animales comprende elementos celulares y humorales que interaccionan para proteger al organismo de patógenos, parásitos y células neoplásicas, de forma que todos los organismos manifiestan una capacidad determinada genéticamente para distinguir entre lo propio y lo extraño. Los organismos multicelulares poco evolucionados sólo presentan un tipo de inmunidad, denominada innata que es exclusivamente celular y filogenéticamente más antigua que la inmunidad adquirida, que está presente en organismos como peces (cartilaginosos y óseos), anfibios, reptiles, aves y mamíferos. células y tejidos del sistema inmune en invertebrados en el sistema circulatorio de invertebrados, se detecta una gran variedad de tipos de células sanguíneas, las cuales, aparentemente, desempeñan funciones variadas como son transporte, almacenamiento, reparación de heridas y pigmentación, así como defensa del organismo. Las respuestas celulares son realizadas por hemocitos, los cuales poseen la capacidad de fagocitar patógenos y desarrollar el proceso de encapsulación de metazoos. poblaciones celulares en hemolinfa de moluscos bivalvos existen diferentes opiniones en relación al número y tipo de hemocitos en moluscos bivalvos, así como en su clasificación celular. La existencia de diversos tipos de clasificación se debe a la variabilidad de técnicas empleadas, que abarcan desde las morfológicas hasta la citrometría de flujo. en la hemolinfa de m. Galloprovincialis han sido detectados dos tipos diferentes de células. En primer lugar, un grupo de células pequeñas redondeadas, denominadas células rh, con un núcleo que ocupa casi la totalidad de la célula y un pequeño volumen de citoplasma, que a veces es tan sólo un halo alrededor del núcleo. el segundo tipo celular encontrado en hemolinfa de m. Galloprovincialis, presenta un mayor tamaño y un citoplasma expandido, son las células sh. el lipopolisacárido bacteriano (lps) y las citoquinas en la respuesta inmune la respuesta inmune está regulada por múltiples y complejas interacciones entre moléculas, las cuales desencadenan señales de transducción intercelulares. Algunas de estas moléculas importantes en la respuesta inmunitaria son el lipopolisacárido bacteriano y las citoquinas.El lipopolisacárido o lps es el principal componente de la membrana externa de bacterias gram-negativas y posee la capacidad para activar macrófagos de vertebrados y hemocitos de invertebrados. objetivos en el presente trabajo se propone como objetivo global, el estudio en manto de mejillón m. Galloprovincialis de alguna isoforma de las cpkcs descritas en otros organismos. este objetivo general puede dividirse en varios subobjetivos: 1) determinar la presencia de actividad cpkc en el manto del mejillón mytilus galloprovincialis lmk. 2) purificar y caracterizar bioquímicamente dicha isoforma de cpkc. 3) estudiar la distribución tisular de la isoforma cpkc purificada del mejillón m. Galloprovincialis lmk. Y determinar su ubicación predominante en las fracciones citosólica y de membrana. 4) obtener anticuerpos policlonales específicos contra la isoforma cpkc purificada, como herramienta para el estudio de la enzima. 5) determinar la presencia de la isoforma cpkc purificada en los hemocitos del mejillón y estudiar el efecto de diferentes inductores (il-2, pdgf y lps) sobre la expresión de esta cpkc en los hemocitos de m. Galloprovincialis lmk. 6) realizar un estudio comparativo de los resultados obtenidos para la forma dependiente de calcio (cpkc) y los obtenidos para la forma independiente de calcio (p105). Para alcanzar este objetivo previamente es necesario completar los siguientes pasos. 6.1. Purificar la isoforma npkc (p105). 6.2. Completar el estudio cinético realizado por mercado, (2001), para la enzima p105 utilizando otros péptidos sustratos. 6.3. Estudiar el efecto producido por diferentes inductores (il-2, pdgf y lps) sobre la expresión de p105 en hemocitos de m. Galloprovincialis lmk. resultados y discusión nuestra investigación se centró en el diseño de un método eficaz para la purificación de una proteína tipo cpkc de manto de mejillón y comparar los resultados obtenidos para esta con los resultados previos obtenidos por mercado y colaboradores. al ser las pkcs enzimas translocables se pueden encontrar tanto asociadas a la fracción citosolica como a la membrana plasmática. Aunque algunos autores han utilizado, preferentemente la fracción de membrana para la purificación de npkcs tanto en vertebrados como en invertebrados, su purificación puede ser más eficiente a partir de la fracción citosolica, tal como han demostrado en este laboratorio mercado y colaboradores. la purificación de la enzima p60 se hizo a partir del manto de m. Galloprovincialis, que había mostrado una elevada actividad cpkc en el estudio preliminar. el primer paso cromatográfico es común a otras purificaciones de cpkcs y npkcs. Las isoformas de cpkcs de vertebrados se eluyen de deae sepharose con una baja fuerza iónica. En higado de rata se obtiene un pico de actividad pkc cuando la concentración de nacl es aproximadamente 100 mm. Las proteínas con actividad cpkc y npkc que hemos purificado a partir de manto de m. Galloprovincialis, requieren en ambos casos de una fuerza iónica menor para su elución, nacl 25 mm. la cromatografía de gel filtración en la columna superdex 200 hr 10/30 permitió purificar a homogeneidad la cpkc de 60 kda que denominamos como p60 y también se puede observar como la otra proteína de 105 kda que denominamos como p105 se va separando de p60 a medida que progresa la cromatografía pasando a tener la p60 totalmente pura en el 2º pico del cromatograma. la cromatografía de adsorción sobre htp, suele ser la que mejor determina la eliminación de contaminantes. En nuestro caso ha permitido obtener la enzima p105 pura, cuando se eluye con fosfato de potasio 300 mm. En la purificación de isoformas de pkc en el molusco aplysia, también se utiliza la cromatografía sobre htp como último paso de purificación, obteniéndose dos picos de actividad pkc, uno cuando el fosfato de potasio alcanza una concentración de 180 mm, y otro se recoge con una concentración de 400 mm. Este segundo pico es coincidente con el que se obtiene con la enzima p105 de mejillón. la purificación por métodos convencionales de isoformas de pkc de invertebrados no es un tema profundamente estudiado. Es el caso del camarón penaeus monodon, de cuyo hepatopáncreas se purificaron tres isoformas similares a pkc ¿, con un peso molecular de 62, 60 y 58 kda. (Es posible que la proteína p60 purificada en el presente trabajo sea similar a alguna de estas pkc delta purificadas por nishizuka). Debido a la utilización del molusco aplysia como modelo para el estudio de las bases neurológicas del aprendizaje, es en esta especie donde se han caracterizado con mayor detalle las isoformas existentes de pkc. De ganglios neuronales de este molusco se han purificado dos pkcs de las cuales la llamada apl-ii posee una masa molecular de 87 kda, mientras que la forma dependiente de calcio o apl-i, posee una masa molecular de 74 kda. En ambos casos menor que la de p105 y mayor que la de p60. Por la cercanía filogenética entre aplysia y el mejillón m. Galloprovincialis es probable que apl-li y p105 sean isoformas similares, aún a pesar de la diferencia de peso molecular. En cuanto a la relación que existe entre estas proteínas y las isoformas de mamíferos solo se puede señalar que los estudios más avanzados en aplysia, han permitido su clonación y se ha constatado una analogía en su secuencia con pkc ¿ de mamíferos. en el presente trabajo se estudió la cinética de la proteína quinasa p60 frente a los sustratos más característicos, obteniéndose para el péptido t5 una km de 68,12 µm, para el péptido t3 se obtiene una km de 841,9 µm, por otro lado para la mbp se obtuvo una km de 69,41 µm, para la histona iii-s obtuvimos una km = 237,98 µm y por ultimo para la protamina sulfato el valor de km fue de 13,46 µm. con respecto a la actividad quinasa de las proteínas p60 y p105, los parámetros cinéticos que hemos obtenido coinciden con los antecedentes descritos para npkcs de mamíferos, las cuales fosforilan débilmente la histona iii-s y la mbp, mientras que tienen una alta afinidad por la protamina sulfato. Por tanto ha sido necesaria la utilización de péptidos sintéticos derivados de la secuencia del pseudosustrato o de mbp, o del receptor de crecimiento epidérmico (egf), para ensayar la actividad quinasa de las npkcs. los resultados obtenidos en nuestro laboratorio para la proteína p105 por mercado y colaboradores, así como los obtenidos para la enzima p60 en el presente trabajo muestran que la p60 muestra una actividad hacia los diferentes péptidos sustratos ensayados del orden de 20 veces más altos que para la p105. La alta actividad fosforilante que p60 y p105 desarrollan con la protamina sulfato, podría deberse a que presenta dos sitios de fosforilación en su secuencia, prrrrsssrpvrrrrrprvsrrrrrrggrrr, en s6 y s20, en comparación con los otros sustratos probados que solo presentan un sitio de fosforilación. Las actividades enzimáticas sugieren que p105 podría catalizar las reacciones de fosforilación de una manera similar a pkc ¿. Los valores de vmáx obtenidos para el péptido sustrato comercial de 9 residuos (vrkrtlrrl) o (t-5) y el péptido sustrato para pkc ¿, ermrprkrqgsvrrrv (s-11), son similares a las que se obtienen con la pkc ¿ de mamíferos. La proteína p105 no solo es independiente de ca2+, sino que además es inhibida por él. Esta característica ya ha sido descrita en isoformas de npkc de mamíferos, en un tipo descrito simplemente como npkc y en el otro que comprende a pkc ¿. Para la enzima p105 de manto de mejillón, la inhibición es de tipo mixta. Siendo preferentemente más afín por la enzima libre, ki 0,6 mm que por el complejo enzima-sustrato, ki¿ 2 mm. en la mayoría de células estimuladas, la concentración de ca2+ se incrementa solo transitoriamente, mientras que las respuestas fisiológicas persisten durante un largo periodo de tiempo una vez que la concentración de ca2+ ya retornó a concentraciones basales. La prolongada activación de pkc parece ser responsable del mantenimiento en la respuesta celular. La movilización del ca2+ y la activación de pkc actúan sinergicamente causando una variedad de repuestas celulares, pero el mecanismo bioquímico de este sinergismo no está completamente estudiado. La movilización del ca2+ y la degradación del fosfolípido están íntimamente relacionadas, y en ocasiones son complementarias entre si. En presencia de altas concentraciones de ca2+, la activación de pkc requiere de una pequeña degradación fosfolipídica, así como en presencia de una intensa degradación fosfolipídica se requiere de una pequeña cantidad de ca2+ para activar la enzima. por otra parte en este estudio, hemos determinado que p60 no solo es dependiente de ca2+, sino que se ha comprobado que la concentración óptima de ca2+ para esta enzima es de 0,65 mm. en este trabajo, también hemos estudiado los efectos de inhibición provocados sobre p60 por inhibidores que compiten por la unión del atp (como la estaurosoporina, para la cual se obtuvo una ki = 20,3 µm o la bisindolilmaleimida, para esta el valor de la cte de inhibición fue de ki = 1,765 µm), también se ensayó el efecto producido por inhibidores de la interacción pkc/fosfolípido (en nuestro caso se utilizó la curcumina como agente representativo de este grupo de inhibidores y se obtuvo una ki = 13,16 µm). Se observa que para los tres casos se obtiene una inhibición de tipo competitiva. en el nematodo caenorhabditis elegans, la actividad de pkc fue inhibida por los inhibidores de proteína quinasa h7 y estaurosporina. Se obtuvo una inhibición máxima para concentraciones que oscilaban entre 9 µm y 8 nm respectivamente. Se ha confirmado que los inhibidores h7 y un inhibidor específico del péptido de pkc rfarkgalrqknvhevkn inhiben la fosforilación del péptido estimulada por el ca2+ / fosfolípido en más de un 98%. para profundizar en la caracterización de las enzimas se obtuvieron anticuerpos policlonales contra p60 y p105. Los anticuerpos obtenidos son específicos para las proteínas puras, y no se observó reacción cruzada en las inmunodetecciones realizadas para las dos isoformas purificadas frente a los respectivos anticuerpos. el análisis de p105, evidenció una característica que la proteína comparte con otras npkcs descritas en mamíferos, pkc ¿, pkc ¿ y pkc ¿. Todas estas isoformas presentan un
Datos académicos de la tesis doctoral «Purificación y caracterización de una isoforma calcio dependiente de proteína quinasa c en mytilus galloprovincialis lmk.«
- Título de la tesis: Purificación y caracterización de una isoforma calcio dependiente de proteína quinasa c en mytilus galloprovincialis lmk.
- Autor: Martín González Riopedre
- Universidad: Santiago de compostela
- Fecha de lectura de la tesis: 27/02/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Juan Ignacio Ramos Martinez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Santiago Rodríguez-segade villamarín
- Mª asunción Cao hermida (vocal)
- pedro alfonso Lazo-zbikowski taracena (vocal)
- (vocal)