Tesis doctoral de Wiwat Nuansing —
El electrohilado (electrospinning) es una t¿ecnica sencilla y muy vers¿atil que se utiliza para lafabricaci¿on continua de micro y nanofibras, principalmente a partir de pol¿¿meros y pol¿¿meros fundidos.El fundamento de esta t¿ecnica est¿a basado en la aplicaci¿on de un alto voltaje (kv) a unasoluci¿on l¿¿quida, la cu¿al forma un chorro que es recogido en forma seca en un sustrato o colectorque est¿a conectado a tierra. Las mol¿eculas no polim¿ericas (mon¿omeros) en general no pueden serelectrohiladas, por lo que tienen que ser mezcladas con alg¿un pol¿¿mero para conseguir una viscosidadsuficientemente alta y un entrelazado intermolecular en la soluci¿on. Sin embargo, muchosp¿eptidos y prote¿¿nas pueden auto-ensamblarse en 3d (cristales), en 2d (prote¿¿nas de membrana)y en 1d (fibrillas naturales) por interacciones intermoleculares, como por ejemplo, fuerzas de vander waals, interacciones electrost¿aticas, enlaces de hidr¿ogeno, e interacciones por apilamiento-¿.En este estudio se demuestra el electrohilado de biomol¿eculas (pol¿¿meros y tambi¿en mol¿eculas/mon¿omeros) es posible en su forma pura. Para ello, estas biomol¿eculas tienen que mostrar autoensamblajeen 1d, 2d o 3d; tienen que ser disueltas en un disolvente org¿anico adecuado a elevadaconcentraci¿on y los par¿ametros del proceso tienen que ser optimizados. Se han desarrollado cuatroconfig.Ciones para la t¿ecnica de electrohilado (ver esquemas en fig. 1). La config.Ci¿on convencional(fig. 1a) es adecuada para el estudio del electrohilado de p¿eptidos y prote¿¿nas, cuando sedispone de soluciones concentradas de al menos 0,1 ml, sin embargo, algunas sustancias se encuentrandisponibles s¿olo en peque¿nas cantidades, y en general el ensayo de nuevos procesos bajodiferentes par¿ametros es m¿as simple y r¿apido a partir de peque¿nas cantidades. Esto ¿ultimo requierela config.Ci¿on del microelectrohilado (microliter electrospinning) (fig. 1b), el cu¿al funciona conalgunos l de soluci¿on. Las config.Ciones tercera (fig. 1c) y cuarta (fig. 1d) se han desarrolladoespec¿¿ficamente para reducir el di¿ametro de las fibras de prote¿¿nas por debajo de 10 nm.Resultados: los resultados experimentales explicados en ambos cap¿¿tulos 4 y 5 (ver el resumenen la fig. 2) apoyan la hip¿otesis de este trabajo: el electrohilado de biomol¿eculas puras, sinser mezcladas con pol¿¿meros, es posible cuando muestran autoensamblaje en 1d, 2d o 3d; cuandose pueden disolver en un disolvente org¿anico adecuado a alta concentraci¿on; y cuando se optimizanlos par¿ametros del proceso (voltaje, distancia, velocidad de flujo, humedad del aire). En losp¿eptidos arom¿aticos, las interacciones intermoleculares (principalmente los enlaces de hidr¿ogeno ylas interacciones de apilamiento ¿-¿) determinan el autoensamblaje. La fuerza electrost¿atica ejercidapor el proceso de electrohilado ayuda al ensamblado de p¿eptidos para organizarse en formade largas fibras. El electrohilado de las prote¿¿nas globulares puras es posible; sin embargo, est¿annormalmente desnaturalizadas: sus estructuras secundarias (h¿elices alfa, hojas beta, etc.) Han cambiadopreviamente en soluci¿on con el disolvente org¿anico. El electrohilado en s¿¿ parece ser muchomenos perjudicial.Los mecanismos propuestos: se propone que las interacciones no covalentes (fuerzaselectrost¿aticas, enlaces de hidr¿ogeno, o fuerzas de van der waals) desempe¿nan un papel vital enla estabilizaci¿on de la formaci¿on de fibras y este papel es similar al autoensamblaje en soluci¿onde los p¿eptidos arom¿aticos. La fig. 3b presenta esquem¿aticamente el mecanismo propuesto encomparaci¿on con el electrohilado de pol¿¿meros (fig. 3a): inicialmente, los residuos arom¿aticospresentes en el p¿eptido causan apilamiento- de las mol¿eculas, lo que resulta en una peque¿na agregaci¿on. Entonces, el electrohilado da lugar a la formaci¿on de fibras. La fig. 3c muestra el mecanismode una soluci¿on de gfg que se autoensambla en fibras antes del electrohilado. En el caso desustancias derivadas del fl¿uor, como 9fm y fmoc-nh2, el chorro de la soluci¿on se rompe en gotitas,que m¿as tarde solidifican por evaporaci¿on del disolvente (fig. 3d). Esto es posible ya que lasinteracciones moleculares no son lo suficientemente fuertes para estabilizar la estructura de fibras.Predicciones: los par¿ametros de la t¿ecnica de electrohilado son muy dif¿¿ciles de predecir,por lo que suelen estar totalmente basados en pruebas emp¿¿ricas. M¿as dif¿¿cil a¿un de predecir esla capacidad de electrohilado – probablemente todas las sustancias se pueden hilar, dependiendode los par¿ametros que a¿un no han sido evaluados. Para los p¿eptidos, el hilado podr¿¿a predecirsecon tres m¿etodos; m¿etodo 1) basado en el aceptor de electrones (an) y en el n¿umero de donantes(dn) del disolvente; m¿etodo 2) utilizando espectros raman polarizados del p¿eptido, que son genvieralmente analizados (por ejemplo, en forma de polvo); y m¿etodo 3) basado en la caracterizaci¿onreol¿ogica de la soluci¿on del p¿eptido. El tercer m¿etodo se ha aplicado y ensayado para las prote¿¿nasglobulares y los resultados indican que el valor m¿¿nimo del n¿umero ohnesorge (oh) requerido parael electrohilado es ¿10.Conclusiones: como resultado de este trabajo a continuaci¿on se resumen las bases generalespara los disolventes adecuados, las condiciones de optimizaci¿on y los par¿ametros para la t¿ecnicade electrohilado.¿ selecci¿on de sustancias: el p¿eptido debe ser capaz de autoensamblarse, por lo que deber¿¿atener muchas propiedades para formar enlaces intermoleculares, especialmente enlaces dehidr¿ogeno. Los grupos laterales arom¿aticos pueden dirigir el ensamblado, pero parece quedejan menos opciones para que se formen los enlaces de hidr¿ogeno, por lo tanto, es preferibleseleccionar p¿eptidos arom¿aticos cortos (ya que sus grupos terminales pueden entonces dominarel ensamblado). Las prote¿¿nas globulares tales como la alb¿umina, la hemoglobina, lacase¿¿na, la lisozima y la insulina tambi¿en se pueden electrohilar sin la adici¿on de pol¿¿meros.Las prote¿¿nas fibrosas (no probadas en este trabajo) deben comportarse bastante similarmentea los pol¿¿meros, y se supone que se electrohilar¿an sin problemas.¿ disoluci¿on: los p¿eptidos arom¿aticos y las prote¿¿nas globulares deben disolverse en un disolventealtamente electrof¿¿lico (an – dn ¿ 88), por ejemplo, en hexafluoroisopropanol (hfip)o en ¿acido trifluoroac¿etico (tfa). La concentraci¿on de la soluci¿on debe ser alta (por encimadel ¿5 % en peso o incluso mayor que el 10 %), con el fin de conseguir fuertes interaccionesintermoleculares, y para lograr las propiedades reol¿ogicas adecuadas (los resultados sugierenun n¿umero ohnesorge (oh) por encima de 10).Viii¿ electrohilado: el voltaje aplicado, la distancia al colector, la velocidad de flujo, y la humedaddel aire (especialmente para el electrohilado de prote¿¿nas) son par¿ametros importantes, queafectan a la morfolog¿¿a de las fibras. Para las biomol¿eculas estudiadas, las condiciones deoptimizaci¿on t¿¿picas son 10¿15 kv, 12¿15 cm, 0.2¿0.5 ml/h (para la config.Ci¿on de microelectrohiladola velocidad de flujo debe ser lo m¿as peque¿na posible), y por debajo del 30 % dehumedad. Para formar fibras ultrafinas de prote¿¿nas (< 20 nm de di¿ametro), el electrohiladodebe realizarse definiendo una distancia extrema entre la soluci¿on y el colector (60¿75 cm),con un voltaje de 20¿35 kv, y aplicando una corriente de aire adicional de ~1 m.S¿1 (porencima de la punta, ver fig. 1d).Aplicaciones: para la posible aplicaci¿on de fibras electrohiladas formadas puramente debiomol¿eculas, es interesante que las fibras de p¿eptidos y prote¿¿nas (de 100 nm hasta micr¿ometros)muestren morfolog¿¿as similares a las de las fibras t¿¿picas de pol¿¿meros biocompatibles. Adem¿as,su qu¿¿mica sugiere una muy alta biocompatibilidad que deber¿¿a permitir su uso en aplicacionesbiol¿ogicas y m¿edicas altamente cr¿¿ticas, por ejemplo, la proliferaci¿on y diferenciaci¿on de c¿elulasmadre. Los andamios hechos de fibras de prote¿¿nas puras o p¿eptidos presentan intr¿¿nsecamentegrupos qu¿¿micos a las c¿elulas, adem¿as, seleccionando prote¿¿nas (o secuencias de amino¿acidos) defamilias de prote¿¿nas que se adhieren de forma natural a las c¿elulas, permitir¿¿a la creaci¿on de unentorno morfol¿ogica y bioqu¿¿micamente optimizado. Recientemente en nanogune se han llevadoa cabo relevantes experimentos en el uso de fibras y c¿elulas, y varias publicaciones est¿ansiendo preparadas (la discusi¿on detallada de esta aplicaci¿on est¿a fuera del alcance de esta tesis).En t¿erminos m¿as generales, las estructuras biofuncionales electrohiladas est¿an siendo estudiadaspara varios fines m¿edicos, por ejemplo, en el vendaje para heridas, en ingenier¿¿a de tejidos, en laadministraci¿on y la liberaci¿on controlada de f¿armacos, y en aplicaciones en enfermedades neurodegenerativas.Muchos de estos estudios est¿an siendo ahora trasladados desde la investigaci¿on haciael desarrollo.Para biomol¿eculas con una funcionalidad menos espec¿¿fica, la morfolog¿¿a de la fibra, la mec¿anicay la qu¿¿mica de superficie pueden proporcionar una ventaja sobre los pol¿¿meros. Estas mol¿eculastienen que estar disponibles en grandes cantidades, tales como la case¿¿na de la leche, los az¿ucares delas plantas, y las hidrofobinas (propias de hongos, pero producidas por bacterias). Estas mol¿eculaspueden ser electrohiladas y aplicadas, por ejemplo, en aplicaciones textiles, para prendas de ropaprotectoras, para el envasado, o como filtros. De la misma manera que las nanofibras cer¿amicasse forman a partir de plantillas de fibras de pol¿¿meros electrohiladas, estas biomol¿eculas tambi¿enpueden servir como fuentes de pol¿¿meros naturales para la producci¿on de nanofibras mineralizadas.En este caso, el revestimiento cer¿amico proporciona la funcionalidad, que puede ser dirigida a unamplio rango de aplicaciones en energ¿¿a y dispositivos electr¿onicos.
Datos académicos de la tesis doctoral «Electrospinning of biomolecules«
- Título de la tesis: Electrospinning of biomolecules
- Autor: Wiwat Nuansing —
- Universidad: País vasco/euskal herriko unibertsitatea
- Fecha de lectura de la tesis: 23/06/2014
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Bittner
- Tribunal
- Presidente del tribunal: José María Asua gonzalez
- ignacio Gonzalez loscertales (vocal)
- marisela Velez tirado (vocal)
- nurit Ashkenasy — (vocal)