Tesis doctoral de Rosana Simón Vázquez
La bacteriorodopsina (br) es una proteína transmembrana expresada por la arqueobacteria h.Salinarum. Ha sido muy estudiada debido a su similitud con la rodopsina visual y otras proteínas de la familia de las gpcrs, además de formar parte de uno de los sistemas fotosintéticos más sencillos que se conocen. la bacteriorodopsina es un transportador de protones que realiza su función gracias a la absorción de un fotón mediante su cromóforo, el retinal, lo que proporciona la energía necesaria para realizar el fotociclo. El resultado final es el transporte neto de un protón desde el lado citoplasmático al lado extracelular. a pesar de que su estructura y función son bien conocidas todavía hay aspectos funcionales que son desconocidos o no han sido suficientemente caracterizados. en este sentido la existencia de un posible movimiento de las hélices e, f y g en el lado citoplasmático durante la función de la proteína, en el proceso de reprotonación, ha sido ampliamente debatido. el hecho de que estos movimientos hayan sido detectados solamente en estructuras cristalográficas de mutantes, pero no en la proteína nativa debido a la dificultad de acumular el intermediario n, ha hecho dudar de su existencia. De la misma manera los trabajos de epr en proteína marcada con una sonda de spin han dado valores muy diversos para la magnitud de estos movimientos, creando también dudas sobre su existencia y su implicación en la función. este trabajo ha tenido como objetivo estudiar la implicación de la flexibilidad de las hélices e-f y f-g en la función de la br. para ello se ha estudiado la implicación de ampliar la longitud, y por tanto la flexibilidad, del bucle e-f mediante la sustitución del bucle nativo por su homólogo en la rodopsina. Este mutante ha sido denominado loop5. por otro lado se ha restringido la flexibilidad de las hélices e y f mediante la expresión del doble mutante f153c/r175c y la formación de un puente disulfuro. Para restringir la flexibilidad de las hélices f-g se usó la misma estrategia y se expresó el mutante e166c/a228c. tanto el aumento de la flexibilidad del bucle e-f como la restricción de la movilidad de estas hélices y de las hélices f y g provoca una profunda alteración en la función de transporte, reduciéndose la efectividad del mismo a aproximadamente la mitad respecto a la proteína nativa. Asimismo el estudio de estos mutantes sitúa este cambio entre los intermediarios m y n y demuestra que es imprescindible para que pueda darse el cambio de accesibilidad desde el lado extracelular al lado citoplasmático, mecanismo que asegura que el transporte sea unidireccional. el aumento de flexibilidad del bucle e-f tiene como consecuencia el aceleramiento del intermediario m. El intermediario n aparece más temprano y tiene un mayor tiempo de vida media. Durante este intermediario sería cuando se produce el movimiento de las hélices y durante el cual la proteína tiene una apertura hacia el lado citoplasmático. al restringir la flexibilidad de las hélices e-f los cambios en el fotociclo no parecen tan relevantes, sin embargo el estudio del intermediario n mediante ftir muestra una alteración en la zona de la amida i que corresponde a los cambios estructurales que tienen lugar durante este intermediario. la restricción de la flexibilidad de las hélices f-g provoca profundas alteraciones en el fotociclo favoreciendo la acumulación del intermediario m. Los intermediario n y o (durante los cuales se reprotona la br) no se forman y el fotociclo sigue otro camino alternativo para volver al estado basal. por tanto, la flexibilidad de las hélices e, f y g tiene un papel muy relevante en la función de la br, sugiriendo que este mecanismo es importante en las proteínas que constan de 7 hélices transmembrana, como las gpcrs.
Datos académicos de la tesis doctoral «Influencia de la movilidad de las hélices en la función de la bacteriorodopsina«
- Título de la tesis: Influencia de la movilidad de las hélices en la función de la bacteriorodopsina
- Autor: Rosana Simón Vázquez
- Universidad: Autónoma de barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 24/02/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Esteve Padrós Morell
- Tribunal
- Presidente del tribunal: pere Garriga solé
- gérard Leblanc (vocal)
- (vocal)
- (vocal)