Tesis doctoral de María Jose Mazon Moya
Resumen el proceso reproductivo en peces, al igual que en el resto de vertebrados, está regulado por una cascada hormonal en la que están implicados el cerebro, la hipófisis y las gónadas, conocido como eje chg. Dos de las principales hormonas implicadas en el control de la reproducción son las gonadotrofinas fsh (hormona estimuladora del folículo) y lh (hormona luteinizante), ambas producidas en la hipófisis y liberadas tras el estímulo con las hormonas liberadoras de gonadotrofinas (gnrh) y con acción a nivel gonadal. desde la perspectiva de la producción animal en general, y de la acuicultura en particular, es esencial conocer en la especie a domesticar los mecanismos básicos de control endocrino. Este conocimiento básico es de gran utilidad para poder manipular la reproducción a conveniencia y al mismo tiempo poder desarrollar estrategias terapéuticas para solventar problemas de fertilidad que en ocasiones presentan los stocks de reproductores. Sin embargo, como consecuencia de la limitación en la disponibilidad de herramientas para su estudio, para una gran mayoría de las especies cultivables de peces se desconocen los mecanismos particulares que controlan su reproducción. en esta tesis se optimiza una alternativa nueva de administración de gonadotrofinas recombinantes, la tecnología conocida como transferencia génica somática. En los capítulos 3 y 4 se inyectaron adultos y juveniles de lubina con construcciones de dna codificante de las gonadotrofinas de cadena única lh y fsh, respectivamente, y se evaluó el incremento de estas hormonas en el torrente sanguíneo. En ambos experimentos las inyecciones de dna se compararon con la inyección directa de la gonadotrofina recombinante correspondiente. Estos capítulos muestran que las construcciones de dna se incorporan a las células musculares en el lugar de inyección, y las hormonas codificadas son sintetizadas y liberadas al torrente sanguíneo. los capítulos 3 y 4 confirman que la transferencia génica somática es una herramienta poderosa para realizar estudios funcionales in vivo con gonadotrofinas, siendo además útil como terapia hormonal en peces, presentándose como alternativa a los tratamientos tradicionales con hcg o gnrh. la funcionalidad de las hormonas recombinantes sintetizadas por las células musculares de lubina tras la incorporación del dna, se determinó estudiando su efecto en el desarrollo de los testículos. En los capítulos 4 y 5 se evaluó como la acción de la fsh es esencial para iniciar el proceso de espermatogénesis, promoviendo la proliferación de las espermatogonias, siendo necesaria la acción posterior de la lh para culminar la espermiación. Los individuos inyectados sólo con el plásmido de fsh presentaron una espermatogénesis parcial, sin indicios de espermiación, estado que sólo alcanzaron aquellos animales que se inyectaron de manera secuencial con los plásmidos de fsh y lh. Estos experimentos también demuestran que la lh por si sola no es capaz de promover la maduración testicular. Además en los análisis de expresión génica se observó que los tratamientos con fsh incrementaron la expresión de marcadores de células germinales como piwi, pcna y scp3, mientras que el efecto de la lh se detectó en enzimas esteroidogénicas como cyp17a1 y cyp17a2. en esta tesis también se describe cómo una de las acciones más directas de la fsh es la estimulación de la producción de 11kt. Con el fin de analizar más en detalle la acción específica de la fsh en la activación de la esteroidogénesis, y de definir mecanismos de regulación conservados entre diferentes especies de peces, se estudió in vitro la acción de la fsh en cultivo primario de testículo y ovario de lubina y pez cebra. en el capítulo 6 se describe cómo la fsh emplea principalmente la ruta del ampc/pka para transmitir su señal una vez activado su receptor, no siendo ésta la única vía, ya que también es importante la actividad de las mapk. Haciendo uso de inhibidores y estimuladores de ambas rutas se ha perfilado un escenario en el que la fsh utiliza de manera independiente las rutas del ampc/pka o las mapk para estimular la transcripción de genes implicados en la esteroidogénesis, como star o cyp19a1a abstract the reproductive process in fish, as in all vertebrate species, is tightly regulated by a hormonal axis, called bpg, involving the brain, pituitary and gonads. Two major hormones that control reproduction are the gonadotropins fsh (follicle-stimulating hormone) and lh (luteinizing hormone) are both produced at the pituitary level, released to the bloodstream after the stimulus of the gnrh (gonadotropin release hormone), and with action at the gonad level. from a fish farming perspective, it is essential to fully understand the endocrine mechanism underlying reproductive performance. This knowledge is important to manipulate reproductive behaviour and for the development of therapeutic strategies aiming to solve fertility issues frequently present in the broodstocks. However, due to the limited tools available for the vast majority of the cultivable species, the mechanisms controlling their reproduction are not well characterized. this thesis describes an alternative administration of recombinant gonadotropins using the technique of somatic gene transfer. In chapters 3 and 4, adult and juvenile sea bass were injected with a plasmid dna encoding lh and fsh gonadotropin sequences in a single chain form, and the levels of either gths were analysed in the bloodstream. In both experiments the plasma levels of gths attained by plasmid dna injected fish were compared with plasma levels of fish injected with the equivalent recombinant gth. Both chapters clearly show that plasmid dna was efficiently incorporated by the cell muscle, and the encoded hormones were synthetized and released to the bloodstream. These results confirm that somatic gene transfer can be a powerful tool for in vivo functional studies of gonadotropin. In addition, this technique can be used for hormone therapy in fish, and can offer a useful alternative to classic treatments with hcg or gnrh. the functionality of the recombinant hormones synthetized by cell muscles after plasmid dna injection was evaluated by studying the development of testes. Chapters 4 and 5 describe the crucial role of fsh in starting the process of spermatogenesis, promoting the proliferation of spermatogonia cells, and its requirements for lh to reach the spermiation process. Fish receiving only fsh plasmid injections showed partial spermatogenesis, with no evidence for spermiation. Only the fish injected with fsh and lh plasmid sequentially reached this late step of the spermatogenesis process. Fish receiving lh plasmid alone showed that gth cannot trigger testis maturation alone. Furthermore, gene expression analysis highlighted the action of fsh on promoting cell proliferation by increasing the expression of germ cell markers such as piwi, pcna piwi, pcna and scp3. By contrast, the effect of lh was more obvious in transcript levels of steroidogenic enzymes such as cyp17a1 and cyp17a2. this thesis additionally describes a direct action of fsh on the stimulation of 11kt production. In order to analyse the specific activity of fsh on the steroidogenesis process in detail, and to define regulatory mechanisms conserved across fish species, the action of fsh in vitro was studied using primary gonad tissue culture from sea bass and zebrafish. Chapter 6 describes the use of the signalling pathway camp/pka by fsh to transduce the signal after the activation of its receptor not clear. Importantly, camp/pka is not the only pathway used by fsh, the mapk route is also involved in fsh signal transduction. The use of camp/pka and mapk inhibitors and stimulators suggest the possibility that fsh can use both routes independently to activate the transcription of some steroidogenic genes such as star and cyp19a1a
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudio de la función de la hormona estimuladora del folículo de lubina: su implicación en la espermatogénesis y sus rutas de señalización intracelular.«
- Título de la tesis: Estudio de la función de la hormona estimuladora del folículo de lubina: su implicación en la espermatogénesis y sus rutas de señalización intracelular.
- Autor: María Jose Mazon Moya
- Universidad: Murcia
- Fecha de lectura de la tesis: 03/11/2014
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Silvia Zanuy Doste
- Tribunal
- Presidente del tribunal: francesc Piferrer circuns
- mercedes Blánquez peinado (vocal)
- Elena Chaves pozo (vocal)
- Francisco Prat baella (vocal)