Tesis doctoral de Manuel Sansegundo Gonzalez
La capacitación espermática puede ser mimetizada in vitro eliminando el plasma seminal por distintos sistemas de lavado y/o incubando a los espermatozoides en medios de composición comparable a la del fluido oviductal. Entre los tratamientos espermáticos empleados habitualmente en los laboratorios para capacitar a los espermatozoides se encuentran los lavados que se realizan con medios enriquecidos con albúmina o a través de gradientes de percoll . No obstante, los resultados de fecundación in vitro entre laboratorios son muy heterogéneos. La explicación a esta variabilidad la podríamos encontrar en el sistema de capacitación empleado o bien el tipo de espermatozoide con el que se trabaja. aunque en la mayoría de los casos, el medio de capacitación contiene sustratos energéticos (piruvato, lactato, glucosa), un aceptor de colesterol (albúmina), hco3- y ca2+, además de determinados electrolitos; el mecanismo por el cual estos componentes promueven la capacitación sigue siendo motivo de estudio y su efecto sobre los espermatozoides también varía según el origen de éstos o según el tratamiento al que se les somete para capacitarlos previamente. Parte del proceso de capacitación ha podido ser ya identificado, así, se ha determinado una correlación entre la capacitación y la salida de colesterol de la membrana plasmática, lo que conlleva un incremento en la fluidez de la membrana, una modificación en la concentración de iones y una hiperpolarización de la membrana. Todo ello es necesario para que se produzca la hiperactivación y finalmente la reacción acrosómica. el objetivo de este trabajo ha sido determinar los cambios que acontecen en los espermatozoides (procedentes de epidídimo y eyaculados) sometidos a tres sistemas de capacitación in vitro evaluados mediante una batería de técnicas que determinan distintos estadios de la capacitación espermática. los espermatozoides de epidídimo procedían de testículos de animales sacrificados en matadero, solamente se utilizaron los espermatozoides procedentes de la cola del epidídimo. Los espermatozoides eyaculados se obtuvieron a partir de verracos de fertilidad probada. Se realizaron tres tratamientos de capacitación: 1) espermatozoides no lavados (nl). 2) espermatozoides lavados en medio pbs con un 0.3% de bsa (pbs-bsa). 3) espermatozoides lavados a través de un gradiente de percoll , 45/75% y 45/90% v/v para espermatozoides epididimarios y eyaculados, respectivamente (percoll). posteriormente, los espermatozoides de los tres grupos experimentales se resuspendieron en el medio de fecundación talp. para la determinación de la capacitación espermática utilizamos la medición de los siguientes parámetros: – parámetros de motilidad espermática determinada por análisis computerizado de imágenes (casa). – incremento de los niveles de ca2+ evaluado mediante espectrofluorometría, utilizando el fluorocromo fura2-am. – producción de especies reactivas de oxígeno (ros) en espermatozoides marcados con h2dcfda y evaluados mediante citometría de flujo. – desorden lipídico de membrana plasmática evaluado mediante citometría de flujo con merocianina 540 (m540) y yo-pro1. – reacción acrosómica, evaluada mediante citometría de flujo utilizando ioduro de propidio (ip) y lectina pna. – penetración in vitro homóloga con ovocitos madurados in vitro cocultivados durante 2 y 4 horas. en lo referente a la motilidad, encontramos que el tratamiento de los espermatozoides y la incubación de los mismos en el medio talp inducen un incremento significativo en todos los parámetros de motilidad estudiados comparados con el grupo control. En cuanto al efecto que tuvo sobre ellos el tratamiento espermático, se observó que el grupo nl mostró un porcentaje de motilidad superior al grupo pbs-bsa. Esta diferencia en la motilidad total no fue determinada en el porcentaje de motilidad progresiva. Por otra parte, se observaron diferencias en el patrón de movimiento. El grupo percoll¿ presentó un patrón distinto a los otros dos tratamientos, con menor velocidad curvilinea (vcl) y menor amplitud lateral de cabeza (alh) pero mayor linealidad (lin) y rectitud (str). Al evaluar el efecto del tratamiento espermático sobre los espermatozoides epididimarios y eyaculados sobre los distintos parámetros de motilidad, observamos que en términos generales los espermatozoides epididimarios mostraron mayor motilidad (total y progresiva), mayores velocidades (vcl, vsl y vap) y menor alh que los eyaculados. el nivel de ca2+ intracelular se incrementó en todos los grupos durante el tiempo de incubación del estudio. En términos generales, la concentración media en espermatozoides eyaculados fue superior a la de espermatozoides de epidídimo (472.27 nm vs. 101.84 nm), y los espermatozoides lavados con pbs-bsa o bien con percoll fueron los que presentaron los niveles más altos de ca2+ (660.42 nm vs. 604.12 nm). La cinética de entrada de ca2+ a lo largo del tiempo fue similar para todos los verracos y para los espermatozoides procedentes de los diferentes epidídimos utilizados en el estudio. la producción de ros fue incrementándose a lo largo del tiempo de incubación y estuvo afectada por el tratamiento espermático y por el origen de los espermatozoides. Los espermatozoides eyaculados produjeron la mayor cantidad de ros, y dentro de éstos, los lavados con percoll . el desorden lipídico de la membrana plasmática de los espermatozoides estudiados estuvo afectado tanto por el origen de los espermatozoides como por el tratamiento de capacitación empleado. Los espermatozoides eyaculados presentaron un mayor porcentaje de células viables y mayor desorden lipídico al inicio de la medición (tiempo = 0). Al finalizar el estudio (135 min) observamos que los espermatozoides de epidídimo presentaban menor desorden lipídico y mayor viabilidad que los espermatozoides eyaculados. El tratamiento con pbs-bsa supuso una reducción de la viabilidad espermática en comparación con el resto de grupos. la reacción acrosómica se vio influenciada tanto por el tratamiento como por el origen de los espermatozoides, de manera que el mayor porcentaje de reaccionados se obtuvo en espermatozoides eyaculados, y dentro de éstos, en los que habían sido lavados con bsa. los resultados de penetración in vitro se vieron afectados tanto por el origen espermático como por el tratamiento al que fueron sometidos los espermatozoides. A las 2 horas de cocultivo la penetración espermática fue significativamente superior cuando los espermatozoides eyaculados habían sido lavados a través de un gradiente de percoll , siendo similar para el resto de grupos. Cuando se dejaron transcurrir 4 horas de cocultivo, los resultados de penetración de espermatozoides epididimarios fueron muy superiores a los eyaculados, salvo para el caso del tratamiento percoll . Además, el mayor número de espermatozoides por ovocito se obtuvo con espermatozoides eyaculados lavados a través de un gradiente de percoll . de los resultados obtenidos se desprende que tanto la procedencia de los espermatozoides (epidídimo o eyaculado) como el tratamiento de capacitación al que se les somete afecta en gran medida a los resultados de la penetración in vitro y por lo tanto, la capacitación se produce de manera diferente entre estos grupos, como se ve reflejado en los distintos parámetros estudiados. No obstante, todos estos parámetros a pesar de que han sido descritos como herramientas para evaluar la capacitación, realmente no son capaces de discriminar o indicar el grado de capacitación en el que se encuentran los espermatozoides, por lo que no los consideramos realmente útiles para estandarizar o predecir los resultados de fiv. Sin embargo, si que podemos afirmar que los espermatozoides eyaculados y lavados a través de un gradiente de percoll presentan un mayor grado de capacitación que el resto de grupos, hecho que se ve avalado por la rapidez con que estos espermatozoides son capaces de penetrar a los ovocitos.
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudio de la capacitación in vitro de espermatozoides epididimarios y eyaculados en la especie porcina«
- Título de la tesis: Estudio de la capacitación in vitro de espermatozoides epididimarios y eyaculados en la especie porcina
- Autor: Manuel Sansegundo Gonzalez
- Universidad: Murcia
- Fecha de lectura de la tesis: 21/07/2008
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Carmen Matas Parra
- Tribunal
- Presidente del tribunal: ginés Salido ruiz
- noemi teresa Marin atucha (vocal)
- Antonio González mateos (vocal)
- raúl Sánchez sánchez (vocal)