Tesis doctoral de Emilio Jose Nogueira Paz
Sok1 (ste20/oxidant stress response kinase) es una proteina kinasa que fue descrita por primera vez por dos grupos de investigación independientes (pombo et al, 1996 y osada et al, 1997). Forma parte del grupo de proteínas ste20 de mamíferos, que se caracterizan por ser homólogas a ste20p de levaduras. Tras su descripción de comprobó que no activa ninguna de las rutas de las mapk hasta ahora descritas, característica que si presenta ste20p, y que también conservan algunos de los homólogas de mamíferos. Las quinasas ste20 se dividen en dos familias, la familia pak y la familia gck. Los miembros de la subfamilias gck-ii (mst1 y mst2) y gck-iii (mst3, mst4 y sok1) presentan una alta homología, y parece que comparten determinadas funciones, por eso a veces se reúnen bajo el término de quinasas mst. Está constituida por 426 aminoácidos, que le otorgan un peso de 48kda y estructuralmente se diferencian en ella un dominio regulador c-terminal y un dominio catalítica n-terminal. Fue la primera ste20 cuya activación se comprobó que se produce en respuesta a estrés celular específico, concretamente en respuesta a estrés oxidativo. Este hecho, junto con algunos estudios preliminares, que parecían indicar que su sobreexpresión provocaba la muerte en la línea celular nih3t3 hizo pensar que podía estar implicada en alguna ruta que regule la supervivencia de la célula en respuesta a este tipo de estrés. estudios posteriores (preisinger et al, 2004) otorgan a sok1 un papel en el mantenimiento de la estructura del aparato de golgi, orgánulo en el que se localiza, y en procesos relacionados con la migración celular, funciones en las que también están implicadas las proteínas gm-130 y 14-3-3¿. en este trabajo de investigación, se demuestra que sok1 está implicada o participa en la regulación de procesos relacionados con la viabilidad celular. Demostramos que su sobreexpresión en diferentes líneas celulares provoca un aumento de la muerte en todas las líneas estudiadas (hek293, hela, saos2 y cos7). Esta muerte es directamente proporcional tanto a la cantidad de proteína sobreexpresada como al tiempo transcurrido posterior a la sobreexpresión. Aunque serán necesarios más estudios para discernir completamente la ruta que conduce a la muerte de las células, después de estudiar algunos aspectos tanto morfológicos como bioquímicos de las células en las que se sobreexpresa sok1, podemos decir que esta muerte se parece más a la apoptosis que a la necrosis. Esto lo ponen de manifiesto hechos como la formación de yemas en la membrana celular, la condensación de la cromatina, el aumento de la cantidad de citocromo c presente en el citoplasma, la necesidad de la actividad de las caspasas para que la muerte pueda producirse, la inactivación por proteolisis de la proteína parp y el hecho de que sok1 traducida in vitro es un sustrato de la caspasa 3. verificamos en este trabajo que tanto la sobreexpresión del dominio regulador c-terminal como del dominio catalítico n-terminal por separado provocan muerte en ambos casos, aunque en menor medida en el caso del dominio c-terminal. Determinamos también en este estudio que la capacidad de activación de la proteína sobreexpresada es independiente de su capacidad para inducir muerte celular. Para esto construimos varios mutantes de sok1 utilizando técnicas de mutagénesis dirigida. Utilizando la misma técnica, determinamos que sí que es necesario para que la sobreexpresión de sok1 induzca muerte celular que se encuentre intacta una secuencia de aminoácidos homóloga a la que se ha caracterizado como señal de localización nuclear en mst1. en este trabajo demostramos que la implicación de sok1 en procesos que regulan la viabilidad celular es un efecto fisiológico de la quinasa y no una consecuencia inespecífica de su sobreexpresión. Esto lo verifica con el hecho de que células donde los niveles de sok1 se reducen mediante sharn son más resistentes a la muerte celular. Estas células son más resistentes al tipo de estímulo que activa a sok1, concretamente a anoxia química, un modelo reproducido in vitro mediante tratamiento de las células con cianuro y 2-deoxiglucosa, y que es equivalente a la isquemia que sufren los tejidos de un determinado organismo cuando se ven privados de aporte sanguíneo. demostramos también que sok1 se activa en respuesta a tratamientos largos con estrés osmótico, y que la disminución de los niveles endógemos de la quinasa también disminuye la muerte celular en respuesta a este tipo de estrés. estudios previos a este trabajo, utilizaron un sistema de doble híbrido para intentar encontrar proteínas que interaccionen con sok1. De todos las que en principio parecían hacerlo, había una, que denominamos sint-5 (mettl2a), que guarda alta homología con metiltransferasas. en este trabajo clonamos la orf de esa proteína en un vector de expresión de eucariotas y demostramos que interacciona con sok1, concretamente con su dominio catalítico n-terminal. Demostramos además que esta interacción disminuye la actividad quinasa de sok1. Por otro lado, también comprobamos que la sobreexpresión de sint-5 provoca algún tipo de modificación en sok1 que retrasa su migración en geles de poliacrilamida. Aunque serán necesarios más estudios, los experimentos realizados en este trabajo, parecen indicar que la sobreexpresión de sint-5 en la célula reduce la muerte celular inducida por sok1. podemos por lo tanto decir, que en este trabajo de investigación se demuestra la implicación de sok1 en la regulación de aspectos relacionados con la muerte celular con características apoptóticas en respuesta a estrés oxidativo y radicales libres, aunque serán necesarios más estudios para establecer concretamente la ruta bioquímica responsable es este proceso. Una función similar se ha descrito para otras proteínas mst, muy próximas filogenéticamente a sok1. Está demostrado para algunos casos, aunque serán necesarios más estudios para verificar que esta posible redundancia funcional se justifica en base a los diferentes niveles de expresión de cada una de las proteínas en diferentes órganos o tejidos y en los diferentes niveles de expresión a lo largo del desarrollo de un organismo. Otra diferencia que parece ser fundamental entre las distintas proteínas del grupo es el tipo de estímulo fisiológico que provoca su activación. por otro lado, demostramos la interacción de sok1 con sint-5, una proteína homóloga a metiltransferasas, y cuya sobreexpresión parece disminuir la capacidad de sok1 para inducir muerte. Serán necesarios más estudios para poner de manifiesto si existen formas de modulación de la actividad o la función de este tipo de quinasas mediante interacción con metiltransferasas.
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudio de la respuesta celular a sok 1 y mecanismos de regulacion«
- Título de la tesis: Estudio de la respuesta celular a sok 1 y mecanismos de regulacion
- Autor: Emilio Jose Nogueira Paz
- Universidad: Santiago de compostela
- Fecha de lectura de la tesis: 23/05/2008
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Celia María Pombo Ramos
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Jesús Antonio Casabiell pintos
- Elena Hidalgo hernando (vocal)
- pedro Crespo baraja (vocal)
- m. luz Barreiro arca (vocal)