Tesis doctoral de óscar Expósito Tarrés
Los cultivos celulares constituyen una promesa y casi una realidad para la producción controlada de un gran número de compuesto secundario de interés, aunque la mayoría de bioprocesos desarrollados hasta el momento no son comercialmente viables. La mayor parte de los estudios llevados a cabo durante las últimas décadas han sido empíricos, es decir se han basado en la optimación de las condiciones de cultivo para incrementar la productividad. Sin embargo, para desarrollar estrategias y tecnologías que lleven a una mejora de la producción de compuesto de interés, es también necesario un profundo estudio de los procesos moleculares de las células, basado en la investigación de los caminos biosintéticos y su regulación. Durante el transcurso de este trabajo, se han llevado a cabo las tareas que se han ido proponiendo en cada etapa de la beca, cumplimiento, en su totalidad, los objetos marcados inicialmente en este proyecto. A continuación, debido a la limitación de espacio estipulada, se describen aquellas tareas consideradas de mayor significación, y los principales resultados obtenidos. 1. Establecimiento un sistema de transformación genética eficiente para la obtención de raíces y cultivos celulares transgénicos de taxus spp. Ingeniería metabólica: las técnicas de ingeniería metabólica aportan nuevas estrategias para la mejora de la producción de fitofármacos, si bien, en una fase previa se requiere la optimización del sistema de transformación vegetal. La obtención de raíces y células transformadas de taxus ha constituidos el mayor éxito de este trabajo, debido a la gran dificultad que presenta este género para su transformación genética. En este trabajo se ha dedicado una gran atención a este aspecto biotecnológico y se han llevado a cabo numerosas estrategias para alcanzar este objeto, habiéndose establecido un sistema de transformación, mediado por agrobacterium, que permite, de forma eficiente y estable, obtener cultivos de raíces y células transformadas de taxus. Esto ha sido posible gracias a la estancia de tres meses que se realizó durante el 2006 en nueva zelanda donde se aprendió esta novedosa metodología de transformación basada en la utilización de cultivos nodriza. Todo ello ha permitido, utilizando las actuales técnicas de la ingeniería metabólica, lograr la sobreexpresión de dos genes que controlan pasos clave de la biosíntesis del taxol y taxanos relacionados, como son los genes dxs y ts que codifican, respectivamente, para las enzimas desoxixilulosa sintasa y taxadieno sintasa en cultivos celulares de taxus. El estudio genético y metabolómico de dichos cultivos ha permitido conocer el mecanismo molecular que ha condicionado los altos niveles de taxanos alcanzados en este trabajo, viendo que la sobre-expresión de la enzima taxadieno sintasa se ha traducido en un aumento en la producción de taxanos respecto a una línea control no transgénica. 2. Respuestas de los cultivos de celulares de taxus baccata a la adicción exógena de taxol: la limitación de la producción biotecnológica de taxol podría deberse a un efecto tóxico de este compuesto sobre las propias células vegetales que lo sintetiza. Nuestro estudio así parece confirmarlo, ya que al adicionar taxol a los cultivos celulares de taxus, se produce una acumulación intracelular del compuesto, a la vez que una reducción de la viabilidad del cultivo. La muerte celular podría estar asociada a un fenómeno de apoptosis, pero los análisis de dna «laddering» parecen descartarlo, sugiriendo que el efecto tóxico del taxol de debe a un mecanismo desconocido. A su vez, la toxicidad del taxol podría ser responsable de la pérdida de viabilidad observada en los cultivos celulares de taxus baccata elicitados. 3. Efecto de la elicitación sobre la producción de taxanos en cultivos celulares transformados y no transformados de taxus spp. Papel de la taxadieno sintasa: el estudio de la respuesta genética y metabólica de los cultivos celulares de taxus spp. A diversas condiciones de elicitación ha permitido profundizar en el conocimiento de las rutas metabólicas que llevan a la biosíntesis del taxol y taxanos afines, y también determinar cómo los factores externos que afectan y controlan la productividad de los mismos condicionan los procesos moleculares que tienen lugar en las células productoras. El planteamiento del estudio de elicitación llevado a cabo en los cultivos celulares establecidos ha permitido apostar datos muy destacados que corroboran la importancia del estado de desarrollo y diferenciación celular en la expresión del metabolismo secundario inducida por elicitores. Para ello, tano en material transformado como en aquél que no lo estuvo, se ha estudiado tanto el nivel de expresión del gen que codifica para la enzima taxadieno sintasa (gen ts), como la actividad de dicha enzima en los cultivos celulares elicitados con jasmonato de melito (jm) y en cultivos de las mismas líneas celulares pero sin elicitar. También se han determinado los niveles de taxanos mediante uplc. los resultados obtenidos muestran una clara acción positiva del jm tanto sobre la expresión del gen ts y la actividad enzimática como sobre la producción de taxanos de las líneas elicitadas. Los máximos niveles de expresión y de actividad taxadieno sintasa se alcanzaron, en todas las condiciones consideradas en este trabajo a los 1-2 días de cultivo. Sin embargo, los máximos niveles de los taxanos determinados se obtuvieron a partir del día 16 después de la elicitación. Este desfase que se produce entre los tiempos de máxima expresión y actividad enzimática, con el momento de máxima producción de máxima producción de taxanos de los cultivos. Confirma que la taxadieno sintasa no cataliza un paso flujo-limitante de la biosíntetica de taxanos, y que deben existir otros pasos posteriores que, en respuesta a la elicitación, controlan el flujo de carbono hacía la producción de taxol.
Datos académicos de la tesis doctoral «Aplicación de la ingeniería metabólica para incrementar la producción de taxol y otros taxanos afines en cultivos in vitro de taxus spp«
- Título de la tesis: Aplicación de la ingeniería metabólica para incrementar la producción de taxol y otros taxanos afines en cultivos in vitro de taxus spp
- Autor: óscar Expósito Tarrés
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 26/03/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Rosa María Cusido Vidal
- Tribunal
- Presidente del tribunal: María teresa Piñol serra
- Juan Segura garcia del rio (vocal)
- (vocal)
- (vocal)