Tesis doctoral de Iris Mercedes Manosalva Peña
En esta tesis se han estudiado algunas de las alteraciones causadas por la vejez en el gameto femenino de mamíferos. La mayoría de los estudios sobre envejecimiento en oocitos se han realizado en condiciones in vitro, por ello aquí se ha estudiado principalmente el efecto de la vejez natural. Se empleó el ratón como un modelo y se estudiaron los oocitos en los estadios de vesícula germinativa (vg) y metafase ii (mii), los cuales se colectaron tanto de hembras jóvenes (3-4 meses de edad) como de viejas (13-17 meses de edad). Los resultados mostraron que ocurren una serie de alteraciones en el patrón de metilación y acetilación de las historias presentes en la comatina del oocito envejecido. Se observó una marcación positiva en vg y mii de hembras jóvenes cuando se emplearon anticuerpos que reconocían metilación de la historia h3 en la lys9 (h3k9me2, h3k9me3), lys4 (h3k4me2), lys36 (h3k36me2), lys79 (h3k79me2) y de la historia h4 en la lys20 (h4k20me). Sin embargo, vg viejas mostraron alteraciones en la metilación de histonas. Estas alteraciones correspondían a una disminución del porcentaje de vg metiladas en h3k9me3, h4k20me2, h3k36me2 y h3k79me2. Asimismo, se apreció una disminución en los niveles de la metilación en h3k9me2 y h3k4me2. Oocitos en mii viejos también mostraron una disminución en el porcentaje de metilación de las histonas h3k9me2, h3k9me3, h3k4me2, h4k20me2, h3k36me2 y h3k79me2. Por otra parte, vg jóvenes la acetilación de la histona h4 en la lys8 (h4k8ac), lys5(h4k5ac), lys12 (h4k12ac) y lys16 (h4k16ac) se observó en vg pero no apareció en mii. Mientras que vg viejas mostraron diferencias con respecto a las jóvenes en los niveles de h4k8ac, h4k5ac, h4k12ac, h4k16ac y una ausencia en la acetilación en h4k12ac y h4k16ac, mii viejos no mostraron mayores diferencias con los jóvenes a excepción de la acetilación en h4k12ac. En vesículas germinativas la cromatina presenta dos configuraciones (nsn y sn) que están relacionadas con una escasa o alta actividad génica. El análisis de los patrones epigenéticos en estas dos configuraciones ha mostrado que entre ellas también aparecen diferencias. Debido a que detectemos alteraciones en las modificaciones de historias quisimos observar si estos cambios estaban relacionados con algunas proteínas específicas. Para ello se eligió la sir2 relacionada con h4k16ac y la hp1 proteína relacionada con la metilación de histona h3 en la histona 9. En oocitos de hembras viejas se observó una disminución de estas proteínas. Teniendo en cuenta que la acetilación de la histona h4k12ac está asociada con la expresión de cdc2a durante la maduración del oocito, analizamos la presencia de dicha proteína en los diferentes casos estudiados. Cdc2a es una proteína importante que participa en el reinicio de la meiosis. Empleando rt-pcr se observó que existía un aumento en la expresión de cdc2a en vg viejas. Sin embargo, mediante inmunofluorescencia se observó que existía una disminución en los niveles de esta proteína, y una disminución de la actividad kinasa de esta proteína. Dado que las condiciones de cultivo empleadas para los oocitos producen diversos cambios en el fameto, analizamos la incidencia de dicha condición. Se observó que oocitos viejos en cultivo presentaban un aumento de la acetilación en mii y una disminución de la proteína cdc2a. Teniendo en cuenta que la maquinaria de acetilación está controlada por las deacetilasas, y ya que en vg de hembras viejas esta maquinaria se encuentra alterada, se inhibió la actividad de estas enzimas para conocer su participación en esta alteración. Los resultados mostraron que después de la inhibición de deacetilasas, aparecía una acetilación de h4k12ac tanto en oocitos jóvenes como viejos. Además, la proteína cdc2a aparecía aumentada en oocitos viejos. Empleando la inhibición de deacetilasas se pretendió revertir el efecto que tiene la vejez sobre la acetilación de la historia h4 en la lisina 12 y sobre la presencia de la proteína cdc2a. Al inhibir la deacetilación por un período corto (1h), aparecieron oocitos viejos en mii deacetilados y con un incremento del porcentaje de cdc2a, al igual que ocurre normalmente en los oocitos jóvenes. Esto mostró que, al menos en estos aspectos, se podía revertir el envejecimiento. Teniendo en cuenta el papel importante que poseen las células del cumulus oophorus sobre la maduración del oocito, se estudió el grado de apoptosis ocurrido en estas células en el caso de hembras viejas. Los resultados obtenidos mediante las técnicas empleadas mostraron que la vejez causó un mayor porcentaje (40%) de células del cúmulus en apoptosis. Los resultados obtenidos permiten concluir que el envejecimiento provoca una serie de alteraciones en algunos factores epigenéticos de la cromatina del oocito en estadios de vg y mii. Además, provoca una disminución de la expresión de algunos genes, como el cdc2a que está relacionado con la acetilación de h4k12ac. Por otro lado, se demostró que una inhibición de las deacetilasas puede revertir el efecto provocado por el envejecimiento. Las modificaciones observadas en la metilación/acetilación de histonas sugieren probables modificaciones en la remodelación de la cromatina por efecto del envejecimiento, lo cual podría alterar ciertos genes que controlan la meiosis y podría causar alteraciones en el estadío de mii.
Datos académicos de la tesis doctoral «Cambios epigenéticos inducidos por el envejecimiento en el oocito de ratón«
- Título de la tesis: Cambios epigenéticos inducidos por el envejecimiento en el oocito de ratón
- Autor: Iris Mercedes Manosalva Peña
- Universidad: Autónoma de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 25/04/2008
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Pedro Esponda Fernández
- Tribunal
- Presidente del tribunal: jose Fernandez piqueras
- isabel Arenas jimenez (vocal)
- Francisco Javier Medina díaz (vocal)
- benito Fraile laiz (vocal)