Tesis doctoral de María Dolores Miramar Gallart
Apoptosis inducing factor (aif) es una flavoproteína con gran homología estructural respecto a proteínas ferredoxina reductasas nadh dependientes acopladas a oxigenasa (onfrs), localizada en la membrana interna mitocondrial que ante un estímulo apoptótico sale de la mitocondria y se transloca al núcleo donde induce condensación de la cromatina y fragmentación de alto peso molecular de aproximadamente 50 kb. Representa una vía apoptótica mitocondrial independiente de caspasas, ya que la inhibición de éstas no afecta su actividad. Desde que se descubriera en 1999, ha sido objeto de una intensa investigación científica en el campo de la apoptosis y también se han publicado numerosos estudios que la relacionan con la embriogénesis, el estrés oxidativo, la fosforilación oxidativa -en relación con el mantenimiento, biogénesis o ensamblaje del complejo i-, el mantenimiento del estado transformado de las células tumorales de colon y el metabolismo celular. Los objetivos de esta tesis doctoral han sido: 1) estudiar las propiedades redox de la flavoproteína apoptosis inducing factor (aif) y realizar un estudio bioquímico de la proteína y determinar sus actividades; 2) determinar la relación de sus propiedades redox con su actividad apoptogénica y 3) analizar los mecanismos moleculares implicados en la transferencia electrónica de la proteína mediante la caracterización de mutantes. Los resultados obtenidos se detallan a continuación. Aifdelta1-120 de ratón (maif; q9z0x1) es una flavoproteína que presenta un único grupo prostético, fad, unido de forma no covalente y con una relación molar 1:1. Se analizó mediante espectroscopía de masas por plasma de inducción acoplado el contenido de metales sin encontrarse cantidades significativas de ninguno. Se determinó mediante cromatografía de filtración en gel y espectroscopía de masas una masa molecular de 57 kda (masa molecular teorica 57046), por lo que a concentración salina cercana a la fisiológica se encuentra en forma monomérica. Mediante derivatización con el reactivo de ellman se comprobó que presenta tres grupos tiol accesibles por molécula que no forman puentes disulfuro y a través del ensayo nadh-dtnb oxidoreductasa se estudió el posible papel de las cisteínas como centros redox. Estas cisteínas no parecen estar implicadas en transporte redox a diferencia de los enzimas de la familia de la glutation reductasa (gr). Maifdelta1-120, maifdelta 1-101 y aifdelta1-102 humana (haif; o95831-1) muestran las características espectroscópicas de una flavoproteína con fad, con máximos en el visible a 378 nm y 450 nm y un hombro a 467 nm. El coeficiente de extinción para maifdelta1-120 es 12.12 mm-1cm-1 y para haifdelta1-102 es 15.37 mm-1cm-1. Maifdelta1-120 une nadh y nadph que, en cantidades equimoleculares, producen la reacción completa de la flavoproteína, sin formación del intermediario semiquinona. Se generan dos complejos de transferencia de carga muy estables con máximos a 637 y 774 nm para el nadh y 740 y 779 nm para nadph. El potencial redox de maifdelta1-120 está fuertemente influenciado por el ph. Maifdelta1-120 presenta valores de potencial redox -264 +/- 12mv a ph 6.5, -308 +/- 15mv a ph 7.5 y -373 +/- 15mv a ph 9, asumiendo una transferencia en un paso de dos electrones. La desviación de los valores teóricos para este tipo de transferencia indica la posible presencia de otros grupos disociables cuyos valores de pka son dependientes del estado redox del enzima. Haifdelta1-102 presenta dos potenciales redox correspondientes a dos transferencias de un electrón consecutivas: -326 y -360mv +/- 10mv a ph 7.5 y 20ºc. Maifdelta1-120 presenta actividad diaforasa con aceptores de un electrón y de dos electrones. Maifdelta1-120 tiene actividades nadh oxidasa, monodehidroascorbato reductasa, citocromo c reductasa y adrenodoxina reductasa. Maifdelta1-120 reducida puede generar anión superóxido en condiciones aeróbicas y esta actividad podría contribuir al incremento de radicales libres de oxígeno tras su salida de la mitocondria. Se ha estudiado la actividad redox «in vivo» en mitocondrias aisladas de hepatocitos de ratón y se ha demostrado que aif nativa mitocondrial posee una actividad nadh oxidasa/nbt reductasa igual a la proteína recombinante. Por otra parte se ha analizado la relación entre la actividad apoptogénica de aif y su actividad redox. La presencia de nadh o nadph, que puede inducir un cambio conformacional en maifdelta1-120, no influye sobre la capacidad apoptogénica de la proteína, y la apoproteína de maifdelta1-120 y maifdelta1-101 presenta la misma capacidad apoptogénica que la holoproteína. Además, la proteína de choque térmico hsp70, que inhibe la capacidad apoptogénica de aif, no afecta a la capacidad redox de maifdelta1-120. Por tanto se concluyó que la actividad redox de maifdelta1-120 y maifdelta1-101 es independiente de su actividad apoptogénica. Finalmente se analizaron los mecanismos moleculares implicados en la transferencia electrónica de aif humana. Para ello se obtuvieron proteínas recombinantes con mutaciones en residuos del centro activo de la proteína (pdb 1m6i) mediante clonación del cdna en el vector de expresión pet28a y purificación por cromatografía de afinidad a metales. Mediante cinéticas rápidas con flujo detenido (stopped-flow) se demostró que los mutantes k177w, e314s, f310g, p173g y w483g, así como el mutante doble k177w/e314s están considerablemente ralentizados en su reducción con nadh (k1 ajustada tanto para procesos bifásicos como monofásicos entre 0.06 y 1.4 s-1) respecto a la proteína salvaje haifdelta 1-102 (kobs>600 s-1) y además la amplitud de la reacción es muy escasa. Por tanto los residuos k177, e314, f310, p173 y w483 están implicados en la transferencia electrónica de haifdelta1-102. También se estudió la reacción de formación de los compejos de transferencia de carga ct1 a 600 nm y ct2 a 720 nm. Se determinaron los potenciales redox para los mutantes de haif f310g y w483g. El residuo f310 modula el potencial redox de la flavina. Su cambio por glicina produce un dramático efecto sobre el potencial redox de aif humana (e0¿= -20 mv, aproximadamente). El potencial redox del mutante w483g resultó -292 mv a ph 7.5 y 20ºc. Se ha propuesto un modelo de reducción de aif con nadh con la formación de cuatro especies intermedias, dos de ellas complejos de transferencia de carga. Mediante modelado computacional se proponen dos modelos de interacción de haif con nad+, según la estructura cristalina del complejo fnr:nad+ (código pdb: 2bsa) y según la estructura cristalina del complejo bpha4:nad+ (código pdb: 2yvj) y gr:nad+ (código pdb: 1get). En ambos modelos la distancia entre las posiciones c4 de la nicotinamida y el n5 de la isoaloxazina permitiría una transferencia de hidruro eficaz.
Datos académicos de la tesis doctoral «Caracterizacion redox de «apoptosis inducing factor» y estudio de los mecanismos moleculares implicados en su transferencia electronica«
- Título de la tesis: Caracterizacion redox de «apoptosis inducing factor» y estudio de los mecanismos moleculares implicados en su transferencia electronica
- Autor: María Dolores Miramar Gallart
- Universidad: Zaragoza
- Fecha de lectura de la tesis: 20/02/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Santos Susin Lopez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: angel Garcia de jalon comet
- milagros Medina trullenque (vocal)
- hans kristian Lorenzo gracia (vocal)
- (vocal)