Tesis doctoral de Carlota Reviriego Herraez
En esta tesis se han desarrollado diversos sistemas para la producción heteróloga de pediocina pa-1 en cepas de lactococcus lactis previamente seleccionadas para la elaboración de quesos debido a sus buenas propiedades tecnológicas. Inicialmente, el plasmido pf12160, que contiene el gen híbrido l-peda (codifica la fusión entre el lider la lactococina a y la propedición pa-1) y los genes icnc y icnd (codifican el sistema de secreción de la lactococina a) se introdujo en l. Lactis esi 153 y l. Lactis esi 515 (nis+). El nivel de producción de pediocina de los respectivos transformantes (l. Lactis cl1 y cl2) fue de aproximadamente 600 y 400 ng/ml, respectivamente, lo que representa un 30 y un 20% de la cantidad producida por pediococcus acidilactici 347, una cepa que produce dicha bacteriocina de forma natural. La transformación de l. Lactis esi 515 con pf2160 no afectó a su capacidad para producir nisina. Posteriormente, se intentó mejorar la producción de pediocina en los mismos hospedadores mediante la introducción de los plásmidos pmc117, prk119 y pcnc16, que contienen el operón completo de la pediocina bajo control del promotor p32. En este caso, el nivel de producción de pediocina de todos los transformantes fue mayor que el obtenido en el estudio anterior basado en el intercambio del líder y sistema de transporte de la lactococina a. Con relación a las cepas recombinantes derivadas de l. Lactis esi 153, la concentración de pediocina en los sobrenadantes de l. Lactis rk1 (prk119) y cnc1 (pcnc16) fue notablemente superior (163-165 %) que la obtenida en los de p. Acidilactici 347. La transformación de l. Lactis esi 515 con cualquiera de estos tres plásmidos tampoco afectó a su capacidad para producir nisina. La producción de pediocina por l. Lactis rk2 (prk119) y cnc2 (pcnc16) fue similar (95-100%) a la de p. Acidilactici 347. En consecuencia, se obtuvieron cepas de l. Lactis con la capacidad de coproducir pediocina pa-1 y nisina a niveles comparables a los de las respectivas cepas parentales. Finalmente, se construyó otro plásmido (pga1) para intentar la producción de pediocina pa-1 en los mismos hospedadores mediante un sistema de grado alimentario. El plásmido pga1 también porta el operón completo de la pediocina bajo control del promotor p32 pero presenta la particularidad de carecer de genes que confieren resistencia a antibióticos. Una vez obtenidos los transformantes de l. Lactis esi 153 y l. Lactis esi 515 (l. Lactis ga1 y ga2, respectivamente), se evaluó su eficacia para inhibir el crecimiento de listeria innocua sa1 durante la elaboración de quesos. Los quesos se manufacturaron a partir de leche inoculada con un 1% de un cultivo láctico (l. Lactis esi 153, esi 515, ga1 ó ga2) con o sin la presencia de l. Innocua sa1 (~4 log ifc/ml). Al final del período de maduración, los recuentos de l. Innocua fueron inferiores a 50 ufc/g en los quesos que contenían l. Lactis ga1 e inferiores a 25 ufc/g en aquellos con l. Lactis ga2. En consecuencia, las cepas desarrolladas pueden resultar útiles como cultivos bioprotectores para controlar el crecimiento de listeria en quesos. por otra parte se investigó si la leche materna contenía bacterias (bal) y, de hecho, se pudieron aislar de leche de ocho madres sanas y de heces de sus respectivos hijos. A continuación, se seleccionaron al azar algunos aislados (178 de cada oveja madre-hijo) y se sometieron a una análisis de sus perfiles genéticos mediante la técnica rapd. De esta manera, se observó que ciertas cepas de lactobacillus gassen y enterococcus faecium se podrían aislar simultáneamente de las muestras de leche, areola mamaria, cavidad oral infantil y heces proporcionadas por una misma pareja madre-hijo. El siguiente objetivo fue la evaluación de la seguridad de las cepas de e. Faecium aisladas de leche humana. Para ello, se investigó la presencia de posibles factores determinantes de virulencia mediante las técnicas de pcr y de hibridación dna-dna. El potencial de las cepas para adquirir plásmidos mediante conjugación se determinó mediante el análisis de genes implicados en los procesos conjugativos de los enterococos. Paralelamente, se realizaron diversos ensayos fenotípicos de propiedades relacionadas con la seguridad de las cepas. La presencia de genes que confieren resistencia a la vancomicina se determinó mediante pcr. Los resultados obtenidos revelaron que todas las cepas estaban libres de determinantes de virulencia. Ninguna de las cepas mostró actividad gelatinasa, producción de hemolisinas o capacidad de agregación. Ninguna portaba los genes vana or vanb genes. Por lo tanto, la leche de mujeres sanas parece ser una fuente de cepas apatógenas de e. Faecium para el intestino del lactante. Finalmente, se investigó las propiedades tecnológicas de estas cepas de e. Faecium aisladas de leche materna y se evaluó su capacidad para inhibir el crecimiento de listeria durante la elaboración de quesos. Su presencia condujo a unos niveles de listeria muy inferiores a los existentes en los quesos controles. En consecuencia, la leche humana es una fuente de enterococos con un gran potencial para ser empleados como cultivos bioprotectores por las empresas del sector lácteo.
Datos académicos de la tesis doctoral «Lactococcus lactis productores de pediocina pa-1 y enterococos aislados de leche materna como agentes bioconservantes en quesos«
- Título de la tesis: Lactococcus lactis productores de pediocina pa-1 y enterococos aislados de leche materna como agentes bioconservantes en quesos
- Autor: Carlota Reviriego Herraez
- Universidad: Complutense de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 25/04/2008
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Juan Miguel Rodríguez Gómez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: lorenzo De la hoz perales
- margarita Medina fernandez-regatillo (vocal)
- gert n Moll (vocal)
- teresa Requena rolanía (vocal)