Tesis doctoral de Eloy Cuadrado Godia
L ictus o infart cerebral es produeix com a conseqí¼éncia d una alteració del flux dels vasos sanguinis cerebrals que pot ser transitori, si aquest es restableix, o permanent, si no s aconsegueix restablir-lo ja sigui espontí niament o mitjaní§ant l acció terapéutica. Com a resultat de la manca de reg sanguini al cervell poden aparéixer tota una série de símptomes neurolí²gics com la afí sia, hemiparésia, pérdua de visió, vertígen, trastorns del llenguatge, entre d altres, i l aparició d uns o altres dependrí de la zona de l encéfal que estigui afectada. Aquests déficits es podran recuperar o no segons l evolució clínica del pacient i del tipus d infart. aquesta malaltia suposa un cí rrega molt important pel sistema sanitari ja que la seva incidéncia anual és d uns 200 casos per cada 100.000 habitants el que suposa un cost sanitari que es calcula entre 3-4% del total. L ictus, tot i no ser tant conegut com l infart de miocardi o el cí ncer per la població en general, és la primera causa de mort en dones (19,038 morts, dades ine 2006) i la segona en homes a l estat espanyol (13,849 morts, dades ine 2006). A més, és la primera causa d incapacitat i invalidesa a llarg termini degut a les greus seqí¼eles sensitives i motores que deixa. l ictus isquémic suposa aproximadament el 80% del total dels ictus que es produeixen. Aquest apareix com a conseqí¼éncia de la oclusió d una artéria de calibre mitjí o gran mitjaní§ant un mecanisme embí²lic (per coí guls, generalment procedents del cor) o trombí²tic (per plaques d ateroma que redueixen la llum del vas i faciliten l assentament de trombus). actualment l única opció terapéutica aprovada pel tractament de l ictus isquémic en la fase aguda és l administració de l activador recombinant del plasminogen tissular, el rt-pa. El rt-pa és un fibrinolític que junt amb el plasminogen endogen, forma un complex que s uneix a la fibrina i la degrada dissolent l émbol i produint la recanalització de l artéria. és important destacar que gairebé 12 anys més tard de que la fda aprovés el tractament de l ictus isquémic menys del 5% del pacients es poden beneficiar de la terí pia en els paí¯sos desenvolupats. Així² es deu en la majoria dels casos als estrictes criteris d inclusió (menys de 4.5 hores des de l inici dels símptomes, pacients no tractats amb anticoagulants i sense cap evidéncia de complicacions hemorrí giques). Degut a aquesta estreta finestra terapéutica, molts pacients no poden ser tractats, en molts casos per problemes amb el transport sanitari i pel temps que es requereix per fer un diagní²stic complert. Desgraciadament, el rt-pa apart de dissoldre el coí gul també té efectes adversos com és l increment del risc de patir transformacions hemorrí giques (th) i efectes neurotí²xics. les transformacions hemorrí giques (th) són uns dels efectes adversos del tractament trombolític més greus. En els pacients tractats amb rt-pa apareixen complicacions hemorrí giques simptomí tiques al voltant d un 5% dels casos i així² comporta una altíssima taxa de mortalitat. L experiéncia mostra perí² que pacients molt semblants, amb el mateix tipus d oclusió, amb el mateix perfil de factors de risc i que són tractats igualment dintre del període de la finestra terapéutica, alguns pateixen th i d altres no. Sembla evident, per tant, que hi ha tot un conjunt de factors individuals que determinen les diferéncies en la resposta al tractament, l aparició de th, el creixement de l infart o l evolució neurolí²gica. la identificació dels patrons moleculars i fisiolí²gics subjacents que determinen aquestes diferéncies pot contribuir a millorar l eficí cia i la seguretat en l administració del tractament trombolític. Aquest és un camp que en l actualitat estí sent objecte de recerca i aquesta tesi, vol contribuir al millor coneixement tant de la malaltia com de la resposta del malalt al tractament. la interrupció del flux sanguini al parénquima cerebral provoca una deprivació de glucosa i oxigen necessaris per a la producció d energia. Si la situació isquémica persisteix en el temps, es desencadena una primera mort neuronal massiva en el conegut com a core de l infart que pot acompanyar-se d una mort secundí ria en les zones perifériques a aquest. En la isquémia cerebral es produeix la interacció de processos tant importants com la necrosi, apoptosi, angiogénesi, proliferació, inflamació, etc. és per tant un sistema complex en el que el patró de la expressió espai-temporal de les diferents molécules pels diferents tipus cel¿lulars determinarí l evolució de l infart, i per tant, del pacient. Els mecanismes implicats són tants i tan complexes que cal fer un estudi més detallat a nivell cel¿lular/subcel¿lular; eines com els microscopis de microdissecció lí ser (lmd) aporten una nova possibilitat per l estudi de les diferents cél¿lules implicades en la patología, permetent discernir la producció de cada tipus cel¿lular i per tant, la seva relleví ncia en l aportació al pool molecular que segueix a la isquémia cerebral. les metal¿loproteí¯nases de matriu (mmps) són una família d endopeptidases zinc-dependents que poden degradar diferents substrats que formen part de la matriu extracel¿lular. L activitat catalítica de les mmps és regulada bí sicament a quatre nivells: en l expressió génica, en la compartimentalització, en l activació del zimogen i en la inhibició de l activitat enzimí tica. A més, les mmps tenen uns inhibidor endí²gens que es coneixen com a timps (tissue inhibitors of matrix metalloproteases). les mmps juguen un paper fonamental tant a la fase aguda com a la fase crí²nica de l ictus. Les mmps poden contribuir al dany neuronal i vascular, al creixement de l infart i a l aparició d hemorrí gies durant la fase hiperaguda, mentre que durant les fases tardanes després d un ictus podrien ajudar en els processos de reparació i modulació de la plasticitat neurovascular. Quines mmps participen en cada un d aquests processos i si tenen diferents funcions en els diferents temps després d un esdeveniment isquémic és quelcom que encara es desconeix. estudis recents demostren que hi ha una sobreexpressió de metal¿loproteí¯nasa-9 (*mmp-9) en sang de pacients que han sofert un ictus i que aquesta sobreeexpressió estí relacionada tant amb el volum de l infart, com amb l evolució neurolí²gica del pacient. A més, sabem que durant l evolució de l ictus, el patró d expressió temporal de proteí¯nes (entre elles les mmps) es modula amb el temps i es relaciona amb la severitat de l ictus i amb l aparició de complicacions hemorrí giques. Fins a avui, en relació a aquestes mmps, hi ha publicats 2 estudis post-mortem en parénquima cerebral humí que mostren un augment de mmp-9 (en la fase més aguda) i de mmp-2 (en la fase més crí²nica) després del ictus en el teixit infartat. El patró d expressió espacial en altres zones del parénquima com la zona de penombra on la viabilitat del teixit estí molt compromesa estí encara per determinar. un dels motius perqué es va decidir estudiar fonamentalment mmp-9 i mmp-2 era la seva qualitat gelatinasa que facilitava l ús de técniques de laboratori senzilles com era la zimografía convencional. Cal pensar, perí², que altres mmps poden jugar també un paper fonamental en la isquémia i hemorrí gia cerebral i l utilització de les técniques d estudi proposades en aquest projecte així ho hauria de posar de manifest. els objectius principals d aquesta tesi doctoral van ser: i. Realitzar una revisió sistemí tica de la literatura sobre l ús de la microdissecció lí ser en l estudi del teixit cerebral i la seva possible aplicació en la investigació de patologies vasculars cerebrals. ii. Investigar l expressió de la mmp-2 i la mmp-9 al cervell isquémic, l origen cel¿lular i la seva distribució en relació amb el trencament de la barrera hematoencefí lica i l aparició de transformacions hemorrí giques en humans. iii. Investigar l efecte del tractament amb rt-pa sobre la degranulació de neutrí²fils humans ex vivo. Específicament, determinar el contingut i alliberació de mmp-9 i d altres mmps/timps per part dels neutrí²fils. iv. Determinar el patró temporal d activació de mmps i la seva distribució subcel¿lular en un model animal d isquémia cerebral focal permanent. v. Investigar l expressió de mmp-13 al parénquima cerebral humí després d un ictus així com en el model animal d isquémia focal permanent i determinar-ne l origen cel¿lular. vi. Estudiar mitjaní§ant arrays de proteí¯nes la producció de mmp/timps en el cervell humí després de l ictus i determinar-ne la contribució específica endotelial i neuronal. així, després dels diversos estudis presentats en aquesta tesi com a compendi de publicacions, varem concloure que: i. La lmd és una técnica prí ctica i fiable que permet aí¯llar poblacions cel¿lulars específiques del parénquima cerebral i que permet obtenir-ne petites quantitats de proteí¯na exclusives d aquests tipus cel¿lulars que poden ser analitzades per técniques de proteí²mica, com són la zimografia en gelatina, el western blot o els elisa múltiples. ii. La infiltració de neutrí²fils a les zones infartades i hemorrí giques i els nivells locals elevats de mmp-9 es relacionen amb la degradació del col¿lagen iv de la lí mina basal i el trencament de la barrera hematoencefí lica. La mmp-9 vascular i de les cél¿lules inflamatí²ries estí directament implicada en les complicacions hemorrí giques que segueixen a un ictus isquémic. iii. El tractament amb rt-pa promou la degranulació dels neutrí²fils ex vivo i l alliberació per part d aquests de mmp-9, a més de mmp-8 i timp-2. iv. L activació de les mmps amb activitat gelatinasa/col¿lagenasa es produeix en els primers instants després de la isquémia, tan aviat com 30 minuts en el model d isquémia cerebral focal en rata. Aquesta actitivitat es localitza inicialment en el nucli de les cél¿lules i en temps més tardans també al citoplasma. v. La mmp-13 és activada al parénquima cerebral humí i de rata després d una isquémia cerebral i es troba fonamentalment en neurones perí² també en oligodendrí²cits i astrí²cits. Aquesta mmp-13, a més, es localitza majorití riament en el nucli d aquestes cél¿lules a la zona de l infart. Així mateix, el tractament de deprivació d oxigen i glucosa promou la seva localització nuclear en cultius neuronals. vi. Mmp-1, mmp-2, mmp-3, mmp-8, mmp-9, mmp-10, mmp-13 i timp-1 es troben augmentades al cervell humí després d un ictus isquémic. En el cervell isquémic, la mmp-9 i el timp-2 són produí¯ts fonamentalment pel component vascular, mentre que la mmp-10 es produeix bí sicament en neurones. dels resultats obtinguts en tots aquests estudis, se n deriven diferents implicacions. En termes generals es poden definir dos compartiments clarament diferenciats respecte la contribució cel¿lular concreta de mmps: les cél¿lules residents del cervell i les cél¿lules circulants. Bons exemples d així² són els nostres resultats, els quals demostren que mentre la mmp-9 prové del compartiment sanguini, la mmp-13 ho fa del propi teixit isquémic. en primer lloc, la mmp-9 alliberada per part dels neutrí²fils participa de la degradació de la bhe i, per tant, és responsable directa de les transformacions hemorrí giques que segueixen a un ictus isquémic. Per tant, la inhibició de la mmp-9 a la fase hiperaguda del ictus mitjaní§ant una terí pia combinada pot millorar l eficí cia i seguretat del tractament trombolític, reduint els sagnats i el creixement de l infart. A més, l activació de les mmps es produeix ja en els primers moments després de la isquémia i és aleshores quan hem d actuar mitjaní§ant la terapéutica si volem inhibir aquestes proteases per intentar reduir el dany isquémic. és també destacable la preséncia al nucli de mmp-13 en cél¿lules molt sensibles a la hipí²xia com són les neurones i els oligodendrí²cits, suggerint una possible implicació directa d aquestes mmps nuclears en processos de mort cel¿lular i, per tant, la inhibició específica d aquestes mmps pot valorar-se com una nova diana terapéutica en el tractament de l ictus isquémic. al mateix temps, els resultats obtinguts confirmen que tant la mmp-9 com la mmp-13 poden ser bons biomarcadors del creixement de l infart com es suggeria en treballs anteriors del nostre grup, ja que reflexen a nivell plasmí tic fení²mens que s estan produint al parénquima cerebral. finalment, la descripció de noves mmps presents i augmentades al cervell demostren la complexitat del procés isquémic, perí² també reforcen la implicació de la família de les mmps en aquest. En un futur prí²xim, aquestes mmps han de ser nous objectius per la recerca en el camp de la patología cerebrovascular i en funció dels resultats se n poden obtenir noves dianes terapéutiques o possibles biomarcadors. en conjunt, els resultats incrementen el coneixement tant de la patología cerebrovascular isquémica en si mateixa com del paper que juguen les mmps en els diferents processos de la patofisiología de la malaltia. Tot plegat els resultats identifiquen noves proteases implicades en els diferents tipus de dany que segueixen al fení²men isquémic, i a més, aporten un millor coneixement en la localització subcel¿lular i de les cél¿lules productores d aquestes mmps tant en el parénquima cerebral com en la unitat neurovascular. buscar un possible benefici del bloqueig selectiu o de la modulació d algunes d aquestes mmps (mmp-9, mmp-8, mmp-10 o mmp-13) en models experimentals són aproximacions que podrien ajudar a millorar la terapéutica de l ictus.
Datos académicos de la tesis doctoral «Las metaloproteasas de matriz en la isquemia cerebral: origen, localización celular y contribución al daño tisular«
- Título de la tesis: Las metaloproteasas de matriz en la isquemia cerebral: origen, localización celular y contribución al daño tisular
- Autor: Eloy Cuadrado Godia
- Universidad: Autónoma de barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 03/03/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Joan Montaner Villalonga
- Tribunal
- Presidente del tribunal: antoni Davalos errando
- Carlos Lopez otin (vocal)
- (vocal)
- (vocal)