Tesis doctoral de Zulema Romero García
El síndrome de hiper-igm ligado al cromosoma x (x-higm1) es una inmunodeficiencia primaria (ips) descrita por primera vez en 1961. Su origen se encuentra en mutaciones en el gen que codifica para cd40l. Cd40l es una glicoproteína de tipo ii, expresada fundamentalmente en la superficie de los linfocitos t cd4+ activados y su expresión está finamente regulada a nivel transcripcional. Su ligando es cd40, receptor de la superfamilia del tnf, expresado principalmente en células b, células dendríticas y fagocitos mononucleares. Cd40l y cd40 juegan un papel crucial en el sistema inmune, debido a que su interacción conduce a la formación de centros germinales, al escape de la apoptosis de las células b y a la activación de las células b induciendo proliferación celular y cambio de isotipo. Como resultado de las mutaciones en cd40l la interacción entre los linfocitos t cd4+ activados y células b se ve alterada, con el consecuente fallo en el cambio de isotipo de las inmunoglobulinas. Las manifestaciones clínicas de esta inmunodeficiencia son infecciones recurrentes, valores muy reducidos de inmunoglobulina g (igg) y niveles normales o elevados de igm. En la mayoría de los casos la enfermedad se pone de manifiesto durante el primer o segundo año de vida, mostrando infecciones recurrentes que incluyen otitis media, infecciones respiratorias y neumonía por pneumoccystis carinii. Otras complicaciones descritas son colangiopatías, tumores y desordenes autoinmunes. solamente el trasplante de médula ósea idéntico permite alcanzar la cura de los pacientes con ips, aunque el 27% de los mismos desarrollan anormalidades tanto endocrinas como neurológicas. El resto de los tratamientos son sólo paliativos. A esto hay que sumar la dificultad de encontrar donantes de médula ósea idénticos. Ante esta situación la terapia génica aparece como un tratamiento alternativo para las ips, mediante la inserción del gen correcto en las células hematopoyéticas pluripotenciales (hscs) del paciente. Los vectores usados con este fin han de ser integrativos en el adn de las hscs con el objetivo de que el transgen se exprese no sólo en la célula transducida, sino en toda su progenie. En el caso de x-higm1 es importante tener en cuenta que, a diferencia de otras ips como scid, scid-ada y was donde los genes mutados se expresan constitutivamente en el linaje hematopoyético, el gen mutado está finamente regulado y cualquier fallo en la regulación de su expresión puede tener efectos fatales. Así lo han demostrado los ensayos de terapia génica en ratones deficientes para cd40l, mediante vectores retrovirales, donde la expresión no fisiológica y constitutiva de cd40l condujo a enfermedades linfoproliferativas. Otro aspecto importante de esta ip es la ausencia de ventaja selectiva de las células que expresan cd40l, puesto que la mutación en este gen no afecta directamente a la supervivencia de los linfocitos t, de modo que las células transducidas no podrán desplazar a las células afectadas por la mutación. Por todo esto es importante tener en cuenta que x-higm1 requiere el desarrollo de estrategias que permitan una expresión eficiente y fisiológicamente regulada de cd40l. con la finalidad de conseguir vectores altamente eficientes y reducir/eliminar la posibilidad de transformación tumoral, se construyeron vectores lentivirales en los que la expresión cd40l está dirigida por promotores humanos hematopoyético-específicos. En una de las construcciones (w-cd40l) se utilizó un fragmento de 500pb del promotor proximal del gen was. Dicho fragmento fue elegido porque previamente se había demostrado en nuestro laboratorio que es capaz de expresar el transgén de forma moderada y hematopoyética-específica. Sin embargo, la forma lógica para conseguir un sistema lentiviral lo más seguro posible sería el uso del promotor de cd40l, para lo cual se seleccionó el fragmento de 1,2 kb descrito por schubert et al. Como control de expresión constitutiva se utilizó el vector s-cd40l, en el que la expresión de cd40l está dirigida de manera constitutiva por el ltr del virus sffv (spleen focus-forming virus). demostramos que el vector w-cd40l mantiene la especificidad para la expresión de cd40l en el tejido hematopoyético. Sin embargo, la expresión dirigida por el promotor de was es constitutiva en el linaje hematopoyético, mientras que la expresión de cd40l debería ser dependiente de activación y restringida a linfocitos t cd4+. A pesar de estas consideraciones, el promotor de was podría ser una alternativa a los promotores constitutivos de los vectores retrovirales, debido a que no sólo restringe la expresión de cd40l a células hematopoyéticas, sino que los niveles de expresión alcanzados a través del promotor de was en las distintas líneas celulares hematopoyéticas estudiadas es, al menos, diez veces menor respecto a la expresión de cd40l obtenida a través del vector constitutivo s-cd40l, lo que supone una ventaja a la hora de reducir potenciales efectos genotóxicos. Por otra parte cabe destacar la eficiencia de transducción vector lentiviral w-cd40l frente a sistemas que, si ciertamente logran una expresión más fisiológica del transgén, no son aún lo suficientemente eficientes. No obstante, habrá que determinar si los niveles de expresión alcanzados a través del vector w-cd40l son lo suficientemente moderados como para no producir transformación celular. ante este posible riesgo de transformación celular, el promotor de cd40l supone la alternativa con más posibilidades de éxito dado que dirigiría la expresión mediante el propio promotor del gen cd40l. Para analizar el patrón de expresión del fragmento del promotor seleccionado (1,2 kb) en un entorno lentiviral se construyó el vector pcd40l-gfp. Los resultados mostraron que el fragmento del promotor de cd40l escogido sigue el patrón de expresión fisiológico de cd40l. Es decir, restringe su expresión a células hematopoyéticas en las que se detectan, al menos, niveles bajos de la proteína cd40l y mantiene su carácter inducible por activación en células t primarias, a pesar de que los niveles de inducción de egfp, en las células transducidas, eran inferiores a los alcanzados por cd40l endógeno en células t primarias sometidas al mismo tipo de estimulación. A continuación demostramos que el vector terapéutico pcd40l-cd40l (en el que le expresión del gen de cd40l está dirigida por el propio promotor de cd40l) mantiene el patrón de expresión observado para el vector pcd40l-gfp. Estos datos avalan que hemos conseguido desarrollar un vector lentiviral terapéutico capaz de expresar la proteína cd40l de forma fisiológica. Sin embargo, a pesar de que estos vectores consiguen una expresión inducible del transgén (tanto el pcd40l-gfp como pcd40l-cd40l), las diferencias de expresión entre las células activadas y las no activadas no llegan a ser tan evidentes como lo que se observa para cd40l endógeno en células t primarias normales. Esto podría indicar que el fragmento del promotor seleccionado, a pesar de conseguir expresión específica en células t, no está optimizado en cuanto a los niveles de expresión tras la activación. Por lo que, en un futuro, proponemos incluir en nuestras construcciones dos nuevos elementos involucrados en la regulación de la transcripción de cd40l descritos en 3¿ y 5¿del gen de cd40l. la funcionalidad de la proteína expresada a través del vector lentiviral pcd40l-cd40l fue corroborada cuando fue capaz de sostener la proliferación de las células b primarias. En efecto, estos análisis de proliferación de células b nos permitieron concluir que la proteína expresada en las células transducidas con nuestros vectores es funcional y capaz de inducir el rescate fenotípico de las células b, in vitro. en resumen, durante el curso de esta tesis se han desarrollado dos posibles vectores terapéutico para x-higm1 (w-cd40l y pcd40l-cd40l) que permiten una eficiente transferencia del transgén, al tiempo que generan niveles de expresión de cd40l, en un caso de forma limitada al linaje hematopoyético (w-cd40l) y en el otro a células t activadas (pcd40l-cd40l). En ambos casos, la expresión de cd40l producida es inferior a la obtenida por vectores de expresión constitutiva (s-cd40l), lo cual será fundamental para reducir los efectos nocivos de la expresión ubicua y ectópica de la proteína. Asimismo la proteína cd40l expresada a través de nuestros vectores lentivirales es funcional, en tanto que es capaz de inducir proliferacion de células b primarias.
Datos académicos de la tesis doctoral «Desarrollo de vectores lentivirales para terapia génica del síndrome de hiper igm ligado al cromosoma x (x-higm1)«
- Título de la tesis: Desarrollo de vectores lentivirales para terapia génica del síndrome de hiper igm ligado al cromosoma x (x-higm1)
- Autor: Zulema Romero García
- Universidad: Granada
- Fecha de lectura de la tesis: 20/05/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Ignacio Molina Pineda De Las Infantas
- Tribunal
- Presidente del tribunal: enrique Garcia olivares
- José Carlos Segovia sanz (vocal)
- cristina Fillat fonts (vocal)
- fº Javier Oliver pozo (vocal)