Tesis doctoral de Rodrigo Amador Aviles Espinosa
La creciente necesidad de observar estructuras complicadas cada vez con mayor contraste y resolución han sido cubiertas por las ventajas inherentes que ofrece la microscopia nolineal. Sin embargo, aun hay ciertos aspectos que deben ser ajustados para obtener su máximo desempeño. Para ello es importante identificar y adaptar los elementos clave que forman un microscopio optimizar la interacción entre estos. Dichos elementos son: 1) el laser, 2) la óptica y 3) las propiedades de la muestra. En esta tesis, se realizan tres estrategias para llevar la eficiencia de la microscopia nolineal hacia sus límites. en la primera estrategia se demuestra de forma experimental como obtener ventaja de las propiedades ópticas de la muestra para generar contraste sin el uso de marcadores mediante la generación de tercer harmónico. Aquí se muestra como la selección de la longitud de onda del láser de pulsos ultracortos es crucial para que la señal obtenida concuerde con la máxima sensibilidad del detector utilizado. Esto permite una reducción de la dosis de luz con la que se expone la muestra, elimina intrínsecamente el requerimiento de esquemas de amplificación de señal y de óptica de tipo ultravioleta (generalmente empleada en este tipo de microscopios). Mediante un estudio comparativo con un sistema convencional se demuestra que los niveles de potencia óptica pueden ser reducidos hasta siete veces. Para demostrar las ventajas de dicha técnica se realiza un estudio completo sobre el desarrollo embrionario de caenorhabditis elegans y los efectos causados por la exposición de la muestra a dicha longitud de onda. Los resultados demuestran el potencial de la técnica para dar seguimiento a procesos morfogénicos en muestras vivas a la longitud de onda utilizada. en la segunda estrategia se diseñó una fuente de pulsos ultracortos que es compacta, de costo reducido y libre de mantenimiento para excitar mediante la absorción de dos fotones uno de los marcadores más utilizados en el entorno biológico, la proteína verde fluorescente. Los parámetros de operación en conjunto con la longitud de onda emitida por el sistema proporcionan la máxima eficiencia permitiendo el uso de potencias pico muy bajas (40 w), ideales para relajar la exposición de la muestra. La versatilidad de esta estrategia se demuestra empleando muestras fijas y vivas con diferentes marcadores fluorescentes. Este láser también es empleado para la obtención de señal de segundo harmónico en diferentes muestras. Adicionalmente, se llevó a cabo un estudio comparativo entre la fuente desarrollada y un sistema titanio zafiro (uno de los láseres más utilizados en laboratorios de investigación). El objetivo final de esta estrategia es introducir fuentes novedosas para aplicaciones portátiles basadas en procesos nolineales. En base a esto se demuestra el uso de dispositivos construidos sobre un microchip para generar imágenes de fluorescencia de dos fotones. Esto permitirá llevar la tecnología hacia la muestra biológica y hacerla disponible para cualquier usuario. en la última estrategia se optimiza de la interacción de la luz con los elementos ópticos del microscopio y la muestra. La primera optimización se lleva a cabo en la trayectoria óptica que lleva el láser hacia el microscopio empleando un elemento adaptable que modifica las propiedades espaciales de la luz. Para mejorar la interacción de la luz y la muestra se miden las aberraciones causadas por la diferencia de índices refractivos entre el objetivo, el medio de inmersión y la muestra. Esto se realizo empleando el concepto de la ¿estrella guía nolineal¿ desarrollado en esta tesis. Mediante la corrección de las aberraciones en el sistema de microscopia nolineal se obtiene una mejora, en algunos casos de un orden de magnitud, en la intensidad total medida. los resultados obtenidos en esta tesis demuestran como el adaptar la interacción entre los elementos clave en un microscopio nolineal permiten llevar su desempeño hacia los límites.
Datos académicos de la tesis doctoral «Strategies for pushing nonlinear microscopy towards its performance limits«
- Título de la tesis: Strategies for pushing nonlinear microscopy towards its performance limits
- Autor: Rodrigo Amador Aviles Espinosa
- Universidad: Politécnica de catalunya
- Fecha de lectura de la tesis: 27/03/2013
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Pablo Loza álvarez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: edik Rafailov
- stephan Niehren (vocal)
- (vocal)
- (vocal)