Tesis doctoral de Ana María Perez Sanchez
Mediante el inmunorrastreo de una genoteca de expresión de candida albicans con un anticuerpo policlonal que reconoce componentes proteicos y glicoproteicos específicos de la pared celular de la forma micelial de dicho hongo, se aisló y clonó un gen contenido en el contig 6-2476 del proyecto de secuenciación del genoma de c. Albicans. Dicho clon contenía un marco abierto de lectura que codifica para un polipéptido de 250 aminoácidos, con un peso molecular aparente de 25 kda. la proteína codificada por dicho gen presentó una señal de anclaje tipo gpi, lo que sugería, en principio, que pudiera tratarse de una especie unida al íY-glucano de la pared celular, aunque otras evidencias apuntaron a que podría ser una proteína de secreción. En su secuencia aminocídica mostraba ocho restos de cisteína en posiciones altamente conservadas, con una elevada probabilidad de intervenir en la formación de puentes disulfuro, por lo que en un principio se pensó que podría tratarse de una hidrofobina, razón por la cual inicialmente se designó al gen aislado como hpb1 (por hydrophobin 1). Sin embargo, para unificar criterios con otras descripciones de este gen hechas por diferentes autores, se decidió utilizar la denominación pga10 (por putative gpi anchor 10), designación que reciben una serie genes que codifican para proteínas con señal gpi a las que no ha sido asignada una función específica, para referirse a dicho gen en el presente trabajo. la secuencia de aminoácidos de pga10p, el producto del gen pga10, presentó los porcentajes de homología/identidad más elevados con dos proteínas de c. Albicans, rbt5p y wap1p/csa1p. Todas estas especies presentan ocho cisteínas en posiciones altamente conservadas en su secuencia. Dicho dominio rico en cisteína, que es diferente al que se encuentra en la secuencia aminoacídica de las hidrofobinas, ha sido denominado con el acrónimo cfem (por common in fungal extracellular membrane proteins). La búsqueda en las bases de datos reveló la presencia de al menos otras dos proteínas en c. Albicans que contienen dicho dominio cfem. con la finalidad de establecer el papel del gen pga10 en la biología de c. Albicans, se procedió a la construcción de un mutante nulo para dicho gen. El análisis fenotípico de dicho mutante, denominado can1, reveló que las células tienden a flocular tras 3 h de incubación en condiciones que inducen el crecimiento en forma de micelio. La cepa mutante presentó también una mayor sensibilidad al rojo congo y, en menor medida, al calcofluor white y al dodecil sulfato sódico, agentes indicadores de la integridad estructural y funcional de la pared celular, así como un aumento de la capacidad de adhesión a plástico y proteínas del suero y de la matriz extracelular de los tejidos animales, y de la hidrofobicidad de superficie celular respecto de la cepa parental cai4-ura3. Estas observaciones sugerían que la interrupción del gen pga10 provoca una cascada de efectos pleiotrópicos que se manifestarían, al menos en parte, en forma de alteraciones en la biosíntesis y/o composición/estructura de la pared celular, alteraciones que fueron puestas de manifiesto al observar la superficie celular de las diferentes cepas mutantes para los genes pga10, rbt5 y wap1 mediante microscopía de fuerza atómica. El análisis comparativo de extractos de la pared celular de levaduras y micelio de las cepas mutante (can1) y parental (cai4-ura3) mediante electroforesis bidimensional también puso de manifiesto la existencia de diferencias importantes en el patrón de especies polipeptídicas presentes en dicha estructura. aunque la capacidad de formar biopelículas de la cepa mutante can1, así como del resto de mutantes nulos con interrupciones en genes que codifican para otras proteínas pertenecientes a la familia del dominio cfem en c. Albicans no parece estar alterada, las biopelículas formadas por dichas cepas fueron más delgadas y frágiles, mostrando una escasa capacidad de adherencia al sustrato. Estos resultados indican que las proteínas que contienen el dominio cfem no participan en las etapas iniciales del proceso formación de las biopelículas, aunque sí que parecen jugar un papel muy importante en el mantenimiento de la integridad estructural de las mismas. La mayor fragilidad y menor capacidad de adherencia al sustrato de las biopelículas formadas por las diferentes cepas mutantes podría estar relacionada con la menor cantidad de matriz polimérica extracelular presente en dichas biopelículas. el análisis proteómico de un extracto de matriz extracelular de las biopelículas formadas por la cepa parental cai4-ura3 puso de manifiesto la presencia de una especie proteica que tras su secuenciación se identificó como pga10p, lo que constituye una evidencia en apoyo de la hipótesis de que esta especie perteneciente a la familia de proteínas que contienen el dominio cfem sería una proteína de secreción que formaría parte de dicha matriz extracelular. La ausencia de la especie pga10p en la matriz de las biopelículas formadas por la mutante nula para el gen pga10 podría estar relacionada con la mayor fragilidad y menor capacidad de adherencia al sustrato mostrada por dichas biopelículas. Una hipótesis semejante podría proponerse en el caso de las biopelículas formadas por las mutantes nulas para los otros genes que codifican proteínas de la familia de polipéptidos que contienen el dominio cfem, estudiadas en el presente trabajo y que también forman biopelículas defectuosas. los estudios de expresión mediante microscopia confocal y citometría de flujo en una cepa de c. Albicans transformada con una construcción en la que el gen que codifica para la proteína verde fluorescente (gfp) se encontraba bajo el control del promotor del gen pga10, reveló que dicho gen se expresaba preferencialmente en las células incubadas en condiciones para inducir el crecimiento en forma de micelio. El análisis mediante pcr en tiempo real (rt-pcr) confirmó estas observaciones, ya que esta técnica mostró, igualmente, una mayor expresión de los genes pga10, rbt5 y wap1 en los filamentos miceliales respecto a las células levaduriformes. Estos resultados sugerían, en principio, que las proteínas pertenecientes a la familia del dominio cfem podrían estar relacionadas con la virulencia/patogenicidad de c. Albicans, puesto que la capacidad de crecer en forma de micelio está considerada como un importante factor de virulencia e invasividad en este hongo. sin embargo, los estudios de virulencia en ratones balc/c empleando los distintos mutantes nulos para los genes pga10, rbt5 y wap1, utilizando en este caso la cepa caf2 como control, reveló que la interrupción de estos genes no inducía cambios significativos en lo que respecta a la virulencia y patogenicidad de c. Albicans. Además, se mantuvo inalterada la capacidad de invasión de diferentes órganos en los animales infectados experimentalmente con las diferentes cepas y, en todos los casos, el mutante simple para el gen pga10 resulto ser más invasivo que la propia cepa control, caf2. Por otro lado, la sensibilidad a diferentes antifúngicos tampoco se vio alterada en las distintas cepas mutantes nulas, tanto en las incubadas en condiciones para inducir el crecimiento en forma planctónica o en biopelículas. El patrón de resistencia a los antifúngicos de uso común en clínica, cuando las células se encontraban creciendo en una biopelícula fue parecido en todos los casos, excepto para los mutantes dobles y triples para los diferentes genes, en los que se apreció un ligero aumento en la sensibilidad a los antifúngicos ensayados. en consecuencia, aunque los resultados presentados en este trabajo representan una evidencia sólida sobre la función potencial que las proteínas pertenecientes a la familia de polipéptidos que contienen el dominio cfem presentes en c. Albicans, tienen en la biogénesis y/o mantenimiento de la integridad estructural de las biopelículas formadas por este hongo, es necesario seguir profundizando en el conocimiento de esta intrigante familia de proteínas para elucidar su papel biológico y funcional, no solo en c. Albicans, sino también en otras especies fúngicas.
Datos académicos de la tesis doctoral «Caracterizacion de cepas del hongo candida albicans con mutaciones en genes que codifican la sintesis de proteinas que contienen el dominio cfem, rico en cisteina«
- Título de la tesis: Caracterizacion de cepas del hongo candida albicans con mutaciones en genes que codifican la sintesis de proteinas que contienen el dominio cfem, rico en cisteina
- Autor: Ana María Perez Sanchez
- Universidad: Universitat de valéncia (estudi general)
- Fecha de lectura de la tesis: 19/06/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- José Pedro Martinez Garcia
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Carlos Monteagudo castro
- Miguel Viñas ciordia (vocal)
- germán Larriba calle (vocal)
- gordon Ramage (vocal)