Tesis doctoral de Javier Martin Renedo
Introducción el carcinoma hepatocelular (hcc) es el quinto tipo de tumor más frecuente, y el tercero por causa de mortalidad en el mundo. Los fármacos utilizados en el tratamiento del hcc normalmente son citotóxicos y ninguno de ellos es específico para el tratamiento de la enfermedad, presentando una gran cantidad de efectos secundarios. Recientemente, ha existido un gran interés en la utilización de los antiangiogénicos en el tratamiento del cáncer. Uno de estos fármacos, la fumagilina, procedente de aspergillus fumigatus fresenius, presenta una potente actividad citostática in vitro. Desafortunadamente, su administración tiene una gran cantidad de efectos secundarios, habiéndose intensificado los esfuerzos por sintetizar derivados con mayor actividad y menores efectos no deseados. Uno de estos derivados, el ppi-2458, análogo activo de la fumagilina, presenta una potente actividad antiangiogénica y menores efectos secundarios. Aunque los estudios son escasos, este nuevo fármaco ha mostrado efectos beneficiosos en diferentes patologías como melanoma y linfoma no hodking. Debido a que no existen datos de los efectos del ppi-2458 en el hcc, en este estudio hemos investigado el efecto antiproliferativo, oncostático y proapoptótico en un modelo in vitro de hcc. materiales y métodos para la realización de este estudio se ha utilizado la línea celular derivada de hcc humano denominada hepg2. Los análisis fueron realizados a tiempos de 0, 2, 4 y 6 días de tratamiento con ppi-2458 a una concentración de 10 nm. Los métodos analíticos empleados fueron la determinación de la viabilidad celular, análisis del ciclo celular, determinación de apoptosis mediante la actividad de caspasas 3, 8 y 9. Junto con estos análisis se midieron por la técnica de western blot, niveles de proteínas relacionadas con ciclo celular (cdk2, 4 y 6, ciclinas d y e, pcna, p21, p53 y rb), con la apoptosis (bcl-2, bad y bax) y con proliferación (erk, akt, jnk p38 y stat3) además, se determinó utilizando la técnica de pcr a tiempo real, la producción de citocinas y factores de crecimiento (tnf¿, il-1íY y vegf). resultados la administración de ppi-2458 redujo la viabilidad de las células de forma tiempo-dependiente a la concentración de 10 nm, mínima concentración utilizada que consiguió reducir la viabilidad en mayor proporción. Tras analizar la viabilidad, decidimos medir los posibles cambios en la cinética del ciclo celular, revelándose un incremento significativo del número de células en la fase g0/g1. Análisis complementarios de marcadores de ciclo celular, mostraron en fase g1 temprana, un aumento de la ciclina d1, sin variaciones en la cdk4 y 6. En fase g1 tardía se observó una disminución de ciclina e, sin cambios en la cdk2, acompañado por un aumento de p21 y una disminución de pcna. en cuanto al estudio de p53, fosfo p53, rb y fosfo rb, se observó un incremento de fosfo p53 sin variaciones en su forma no fosforilada, y una disminución en fosfo rb con un aumento paralelo de rb total. al determinar la actividad de las caspasas 3 8 y 9, se mostró un incremento de tales actividades tras seis días de tratamiento con el fármaco objeto de estudio. El análisis de proteínas relacionadas con la apoptosis reveló una disminución en bcl-2, sin variaciones en bax y bad. Al medir vías señalización relacionadas con la apoptosis y la proliferación se observó una bajada de fosfo erk y fosfo akt, sin alteraciones en fosfo p38 y fosfo jnk. Los niveles totales de estas proteínas no mostraron ningún cambio. En cuanto a stat3 se determinó la existencia de un incremento de la forma activada de este factor de transcripción. al utilizar un inhibidor de stat3, stattic, durante 4 días se vislumbró que tanto fosfo stat3 como la ciclina d1 y p21, disminuían por la administración del mismo en combinación con ppi-2458 o solamente con el inhibidor. el estudio del efecto del ppi-2458 sobre la síntesis de rna mensajero de citocinas inflamatorias y factores de crecimiento, reveló que la administración de ppi-2458 inducía un aumento de las tres moléculas estudiadas, tnf¿, il-1íY y vegf. La inhibición de stat3, en combinación con el fármaco objeto de estudio, no produjo cambios en la síntesis de tnf¿, incrementó la producción de il-1íY y disminuyó los niveles de vegf. discusión el estudio demuestra que el ppi-2458 inhibe la proliferación, la progresión del ciclo celular e induce apoptosis cuando este fármaco se administra a las células durante 2, 4 y 6 días a la concentración de 10 nm. Los efectos antiproliferativos del ppi-2458 se ha demostrado previamente en células de melanoma y de linfoma no hodking. Al analizar el ciclo celular, se observó una parada del mismo en la fase g0/g1. Estudios previos han mostrado efectos similares de la fumagilina sobre el ciclo celular en la misma fase, además nuestro grupo de investigación ha publicado previamente que el tnp-470, otro derivado de la fumagilina, detenía el ciclo en dicha fase en un modelo in vivo de hcc. En células eucariotas la fase g1 temprana se controla por la ciclina d y las cdks 4 y 6, mientras que en la fase g1 tardía, dicho control se lleva a cabo por la ciclina e y cdk2. Nuestro estudio ha demostrado que la administración de ppi-2458 incrementó la expresión de ciclina d1 y disminuyó la ciclina e, sin cambios en las cdk4, 6 y 2. Resultados similares se han observado tras la administración de tnp-470 en células huvec, estando asociado el aumento de ciclina d1 con una mayor sensibilidad de las células huvec al tnp-470. En cuanto a pcna, factor de procesividad de la adn polimerasa, se trata de un proteína que se asocia físicamente a p21. La unión de pcna y p21 impide la acción ciclostática de ésta última proteína en la fase g1. En nuestro estudio ppi-2458 fue capaz de reducir la expresión de pcna, resultado en concordancia con la disminución de esta proteína en resultados alcanzados por otros autores cuando el fármaco fue utilizado en un modelo de artritis reumatoide. Como ya se ha indicado previamente por otros autores, la parada del ciclo en fase g1 está relacionada con p53 y p21. Nuestros resultados están de acuerdo con tales observaciones, ya que la administración de ppi-2458 produjo un incremento de la forma fosforilada de p53 y de p21, además de se ha demostrado el incremento del p21 debido a este fármaco en células de melanoma. la fosforilación de rb que permite la liberación de e2f precipitando en fase s, puede ser debida al complejo ciclina e-cdk2. La administración de ppi-2458 disminuyó los niveles de fosfo rb, pudiendo asociar estos cambios a la diminución de los niveles de ciclina e y al incremento de p21, que inhibe el complejo cilcina e-cdk2. El factor de transcripción stat3 actua, generalmente, como promotor de la supervivencia y de la proliferación celular, pero también es capaz de regular la síntesis de cilcina d1 y de p21. Estos resutados están en condordancia con los nuestros, que muestran la disminución de la ciclina d1 y de p21 cuando se administró stattic (inhibidor de stat3) y ppi-2458 a las células hepg2. las vías de señalización akt y erk están asociadas a la proliferación y supervivencia. También se ha visto que pueden inducir la producción de bcl-2, proteína antiapoptótica que puede evitar la muerte celular. Por el contrario, jnk y p38 pueden inducir miembros proapoptóticos de la familia de proteínas bcl-2: bax y bad. En nuestros experimentos hemos detectado una disminución de fosfo-akt y fosfo-erk tras seis días de tratamiento, sin variaciones en los niveles de jnk y p38 tanto totales como fosforilados. Estos resultados están de acuerdo con los obtenidos por otros autores que muestran que, tras la administración de tnp-470, se produce una disminución de fosfo-akt y de fosfo-erk, sin cambios en p38 (wang et al., 2006). En nuestros experimentos la incubación de las células con ppi-2458 incrementó la actividad de las caspasas 3, 8 y 9 y disminuyó los niveles de la proteína bcl-2, sin cambios en bax y bad. Aunque no existen datos sobre los efectos proapoptóticos del ppi-2458, la disminución en bcl-2 sin cambios en bax y bad se ha observado en hcc cuando se administran otro tipo de fármacos, y la administración de tnp-470 en cáncer de mama, es capaz de disminuir los niveles de bcl-2 y de inducir apoptosis en diferentes tipos tumorales. la investigación sobre el ppi-2458 está vinculada al estudio de la liberación de citocinas. Estudios previos no determinaron variación alguna en estas moléculas tras la administración del fármaco objeto de estudio, aunque tales investigaciones realiza incubaciones con el fármaco a tiempos más cortos. De tal manera, la administración de ppi-2458 reveló un incremento en la producción de arn mensajero de tnf¿, il-1íY y vegf. la activación de stat3 puede ser debida a la il-1íY, que puede inducir la parada del ciclo celular, pudiendo sugerir una relación con la detención del ciclo provocada por el ppi-2458. Además, podemos especular sobre la relación entre el tnf¿ y la il-1íY, ya que se ha publicado que esta última puede inducir la síntesis de tnf¿. La utilización de stattic, impide la activación de stat3, necesaria para que actúe como factor de transcripción. El empleo de este inhibidor en nuestro estudio, reveló que el bloqueo de stat3 no disminuía la síntesis de arn mensajero de tnf¿, incrementándose además la producción de arn de il-1íY. El bloqueo de stat3 en distintos modelos de estudio, ha revelado que puede disminuir la síntesis de il-1íY sin cambios en tnf¿, pueden incrementar ambas citocinas, o incluso disminuirlas . Nuestros hallazgos y los de otros autores parecen indicar la existencia de otros factores implicados en el control de la liberación y producción de citocinas. en cuanto al vegf, principal factor proangiogénico, tiene una relación directa con stat3, ya que la inhibición de este factor de transcripción es capaz de bloquear la síntesis de vegf, además de reducir el crecimiento tumoral y la metástasis. Estas observaciones están en concordancia con nuestros resultados, donde el ppi-2458 incrementó la forma activa de stat3, aumentando en paralelo los niveles de arnm de vegf, mientras que la inhibición de stat3 disminuyó la producción de vegf. el estudio realizado indica que el ppi-2458 es capaz de reducir la viabilidad, detener el ciclo celular e inducir apoptosis en las células hepg2 derivadas de hepatocarcinoma. La disminución en la tasa de crecimiento puede estar mediada por la proteína stat3, debido a su papel en la sobreexpresión de la ciclina d1 y de p21. A la luz de estos hallazgos, podemos afirmar que el ppi-2458 puede, potencialmente, ser utilizado en la terapia farmacológica para el tratamiento del hcc. Sin embargo se necesitan estudios ulteriores que puedan elucidar los mecanismos por los cuales este fármaco produce la inhibición del crecimiento de hcc.
Datos académicos de la tesis doctoral «Efecto de la administración de ppi-2458 sobre los procesos de proliferación celular y apoptosis en un modelo in vitro de hepatocarcinoma«
- Título de la tesis: Efecto de la administración de ppi-2458 sobre los procesos de proliferación celular y apoptosis en un modelo in vitro de hepatocarcinoma
- Autor: Javier Martin Renedo
- Universidad: León
- Fecha de lectura de la tesis: 20/10/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- José Luis Mauriz Gutierrez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Jesús Culebras fernández
- ulla Stenius (vocal)
- María victoria García mediavilla (vocal)
- Juan Francisco Medina cabrera (vocal)