Tesis doctoral de Basilio Zafrilla Requena
De un tiempo a esta parte, haloferax mediterranei se ha convertido en un modelo para el estudio de microorganismos halofílicos. Esta arquea, es capaz de reducir nitrato a través de las dos principales rutas presentes en el ciclo del nitrógeno. Dependiendo de las condiciones del medio, este microorganismo es capaz reducir el no3- hasta nh4+ con el fin de incorporarlo en su metabolismo. Este tipo de metabolismo se da cuando el organismo detecta escasez de nh4+ o aminoácidos. Asimismo, este microorganismo es capaz de reducir el no3- hasta nitrógeno elemental a través de una cadena respiratoria. Mediante esta vía, el no3- es utilizado como aceptor terminal de electrones, logrando una fuente de energía alternativa cuando la concentración de oxígeno se vuelve limitante para el crecimiento. los resultados derivados del estudio de ambas vías han suscitado un gran interés biotecnológico dada la capacidad potencial de estos microorganismos para ser utilizados en la biorremediación de suelos altamente eutróficos. Estos suelos, generados por el uso abusivo de fertilizantes y con una alta concentración de sales, suponen un peligro para las actividades humanas debido a la posibilidad de contaminar acuíferos subterráneos a través de su lixiviación. Dado que la respiración y la asimilación de no3- son dos vías inducibles en hfx. Mediterranei, el estudio de ambas rutas metabólicas y su posible empleo en biorremediación se encuentran totalmente subordinados a las condiciones del medio en que se desarrolla el microorganismo. A partir de esta premisa, se genera la necesidad de alcanzar una expresión controlada de la maquinaria enzimática de ambas rutas, bien para profundizar en su caracterización o bien para estudiar su posible aplicación. los métodos de expresión heteróloga utilizando e. Coli como huésped han resultado efectivos para obtener de forma activa un gran número de enzimas halofílicas. No obstante, parece que las condiciones existentes en el citoplasma de este huésped mesófilo no son las adecuadas para la expresión de enzimas dependientes de cofactores complejos como las presentes en la maquinaria asimilativa y respiratoria del no3-. Asimismo, los protocolos de renaturalización a partir de cuerpos de inclusión, tampoco han ofrecido una solución efectiva a este problema. Esto se debe a que la incorporación de cofactores durante el plegamiento de estas enzimas, es un proceso complejo que depende en gran medida de maquinarias enzimáticas auxiliares especializadas en el plegamiento de proteínas. a lo largo de este trabajo, se han buscado alternativas a la técnica de expresión heteróloga con el objetivo de mejorar los rendimientos y el control de la expresión dependientes del microorganismo. Para lograr este objetivo, se han abierto dos líneas de investigación alternativas. En la primera de ellas, se ha estudiado todo lo relacionado con la síntesis de centros [fe-s] en organismos halofílicos. Estos cofactores metálicos están presentes en un gran número de enzimas involucradas en la asimilación y respiración. Asimismo, mediante el estudio de otros organismos, se sabe que la síntesis de estos centros no ocurre de manera espontánea sino que requiere de diversas maquinarias celulares específicas. La enzima central de estos complejos es una cisteín desulfurasa (cd) denominada comúnmente como proteína tipo nifs. De esta manera, gran parte de la investigación de este trabajo se ha centrado en la identificación y caracterización de enzimas con actividad cd presentes en organismos halófilos, a través de una aproximación tanto genómica como proteómica. En este sentido, se han descubierto, clasificado y caracterizado varias enzimas tipo nifs involucradas en mayor o menor grado en la de síntesis de centros [fe-s] de organismos halófilos. De igual manera, se ha valorado su posible aplicación para la renaturalización in vitro de la nitrito reductasa asimilativa de hfx. Mediterranei (hm-nir). en la segunda línea de investigación, se ha trabajado con la posibilidad de reemplazar la expresión heteróloga en e. Coli por una expresión homóloga en un organismo halófilo como hfx. Volcanii. Al lograr este objetivo, se evita tener que llevar a cabo renaturalización in vitro de la proteína expresada, ya que teóricamente el citoplasma del huésped halofílico proporciona gran parte de las condiciones necesarias para el plegamiento espontáneo de la proteína recombinante. Tras poner correctamente a punto la nueva técnica, se ha comprobado su utilidad llevando a cabo de manera eficiente la expresión y la caracterización tanto de la enzima asimilativa hm-nir, como de la nitrito reductasa respiratoria de hfx. Mediterranei (hm-nirk). finalmente, cabe destacar que los datos obtenidos a partir de cada una de las dos líneas de investigación han supuesto una gran aportación al conjunto de técnicas empleadas en la expresión de proteínas halofílicas. Asimismo, se ha dado un primer paso hacia la compresión de los mecanismos presentes en haloarqueas para la síntesis de cofactores tan esenciales y tan ampliamente distribuidos como los centros [fe-s]. Asimismo, cabe destacar que a través de este trabajo, se ha mejorado sustancialmente la caracterización a nivel físico-químico, cinético y estructural de dos enzimas clave para la asimilación y respiración de no3- como son la hm-nir y la hm-nirk.
Datos académicos de la tesis doctoral «Expresión recombinante de proteínas relacionadas con el metabolismo del nitrógeno en haloferax mediterranei«
- Título de la tesis: Expresión recombinante de proteínas relacionadas con el metabolismo del nitrógeno en haloferax mediterranei
- Autor: Basilio Zafrilla Requena
- Universidad: Alicante
- Fecha de lectura de la tesis: 22/07/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- María José Bonete Pérez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: José María Vega piqueres
- julia m. (secretario) Esclapez espliego (vocal)
- Juan Luis Serra ferrer (vocal)
- Francisco Castillo rodriguez (vocal)