Tesis doctoral de Irene Latorre Rueda
Diagnóstico de la infección por mycobacterium tuberculosis mediante estimulación de las células t sensibilizadas con antígenos específicos. el factor esencial para el control de la expansión de la tuberculosis (tb) radica en la capacidad de diagnosticar precozmente y tratar a los individuos enfermos de forma apropiada. Por otro lado, las personas infectadas representan un peligro potencial de nuevos casos de tb. El estudio de las personas infectadas que no han enfermado permite aplicar, según los casos, medidas de prevención y evitar que estas personas desarrollen la enfermedad. Con esta medida se contribuye a romper la cadena de transmisión del microorganismo. para conocer si un individuo ha sido infectado por mycobacterium tuberculosis se estudia su respuesta de hipersensibilidad retardada frente a determinados compuestos antigénicos específicos del bacilo. Este sería el principio en que se basa la prueba de la tuberculina (pt). La tuberculina, que se obtiene del filtrado del cultivo de m. Tuberculosis esterilizado y concentrado, actualmente está constituida por ppd. La tuberculina ha sido utilizada durante los últimos 100 años como herramienta de ayuda en el diagnóstico de la tb. Su principal inconveniente radica en que la mayoría de proteínas presentes en el ppd no son específicas de m. Tuberculosis sino que las comparte con otras micobacterias no tuberculosas (mnt). Esto provoca una disminución en la especificidad de la prueba, ya que individuos sensibilizados por exposición previa a otras mnt o vacunados con la bcg también responden inmunológicamente al ppd. Además, la pt presenta una baja sensibilidad en pacientes con alteraciones en la inmunidad celular. atendiendo a la historia natural de la enfermedad, la principal vía de infección es la llegada de m. Tuberculosis a los alvéolos pulmonares, donde es fagocitado por los macrófagos alveolares. Estos macrófagos liberan citoquinas que atraen neutrófilos, linfocitos y más macrófagos para que fagociten a los bacilos extracelulares, así como para que generen un foco inflamatorio. Los linfocitos t cd4 específicos se transforman en linfocitos th1 bajo la influencia de la il-12 secretada por los macrófagos. La respuesta th1 segrega el tnf-alpha, que permite la llegada de más macrófagos, y de ifn-gamma que activa a los que están infectados. la citoquina efectora clave en el control de la infección micobacteriana para la activación de los macrófagos y el desarrollo de la inmunidad protectora contra m. Tuberculosis es el ifn-gamma. Por lo tanto, un método de inmunodiagnóstico basado en la cuantificación in vitro de la respuesta inmune celular puede ser una alternativa a la pt para identificar la infección tuberculosa. en este sentido se han desarrollado diferentes métodos de cuantificación de esta respuesta inmune celular utilizando diferentes antígenos micobacterianos para la estimulación de las células t sensibilizadas y para la detección in vitro de la liberación de ifn-gamma. Fundamentalmente se han basado en técnicas de elisa y elispot, que respectivamente han dado lugar a dos técnicas disponibles comercialmente: qfn-g-it y t-spot.Tb. La tecnología consiste en una estimulación in vitro de los linfocitos con antígenos específicos micobacterianos, seguido de una detección del ifn-gamma producido mediante técnica inmunológica. El éxito de esta tecnología depende entre otros factores de los antígenos que se emplean durante la estimulación. La utilización de antígenos codificados en la región rd1, como por ejemplo esat-6 y cfp-10, que son antígenos secretados por el complejo m. Tuberculosis y que están ausentes en la vacuna bcg y en otras mnt, parecen tener una gran capacidad en la detección de individuos infectados por m. Tuberculosis. de esta forma, la tesis se ha centrado en la estandarización y evaluación clínica de estas nuevas técnicas inmunológicas para el diagnóstico de la infección tuberculosa (estudios de contactos y cribados) y tb activa, así como su aplicabilidad en la práctica clínica en pacientes adultos y pediátricos, y el estudio del efecto de las mnt sobre la positividad de la pt. en uno de los apartados de esta tesis se exponen los resultados obtenidos al estudiar estas dos nuevas técnicas in vitro basadas en la detección de ifn-gamma en 492 adultos y 134 niños para el diagnóstico de la infección tuberculosa y la tb activa en la práctica clínica, comparando los resultados con los de la pt. en nuestra experiencia, observamos que el porcentaje de resultados positivos por la técnica del t-spot.Tb es mayor que la del qfn-g-it, tanto en el diagnóstico de la tb activa como en el de la infección tuberculosa. Nuestros resultados también muestran que ambas técnicas in vitro están menos afectadas que la pt por la vacuna de la bcg, y que las concordancias entre las tres técnicas son más elevadas en población no vacunada. además, hemos determinado el papel que juega la sensibilización por mnt en las discordancias entre la pt y la técnica de t-spot.Tb. Se estudiaron retrospectivamente 21 niños con una pt positiva y un t-spot.Tb negativo, que no estaban vacunados con la bcg, y se detectó la presencia de células sensibilizadas frente a mnt estimulando con sensitinas de mycobacterium avium. de los 21 niños, en 10 (47.6%) casos se obtuvo un resultado positivo tras estimular con sensitinas de m. Avium. De los 10 niños en que se obtuvo un resultado positivo tras estimular con sensitinas de m. Avium, 8 fueron incluidos durante estudios de cribado de infección tuberculosa, mientras que solamente 2 de ellos pertenecían a estudios de contactos. Respecto a las induraciones de la pt de estos 10 niños, en 8 (80%) casos ésta resultó estar entre 5 y 10 mm. nuestros resultados evidencian que una sensibilización previa en niños por mnt puede inducir un resultado falso positivo en la pt en el diagnóstico de la infección tuberculosa. a pesar de que no existe una técnica de referencia para el diagnóstico de la infección tuberculosa, es bien conocido que en pacientes inmunodeprimidos la pt tiene una sensibilidad bastante reducida en este tipo de pacientes. De este modo, otra aportación de esta tesis fue comparar ambas técnicas de inmunodiagnóstico in vitro con la pt para el diagnóstico de la infección tuberculosa en 75 pacientes vih, y evaluar la influencia del número de células cd4 en la aplicabilidad de estas técnicas. en este estudio observamos un bajo porcentaje de resultados positivos por las tres técnicas, y al mismo tiempo, una baja concordancia entre ellas. Nuestros resultados evidencian que las técnicas inmunológicas in vitro están menos influenciadas que la pt por la vacuna de la bcg, por lo tanto son más específicas. Por lo que respecta al número de positivos en función de las células cd4, ambas técnicas in vitro se ven afectadas por el nivel de inmunosupresión. Sin embargo, el t-spot.Tb parece estar menos afectado por la inmunosupresión severa, ya que observamos por esta técnica un resultado positivo en un paciente con número de cd4 inferior a 100, y ninguno por qfn-g-it y pt. De este modo, el uso de las técnicas in vitro puede ser de utilidad en el diagnóstico de la infección tuberculosa en este tipo de pacientes, además, con estas técnicas se puede detectar ausencia de respuesta inmune ya que presentan controles internos que permiten identificar falta de respuesta en pacientes anérgicos. aunque las técnicas basadas en la detección de ifn-gamma liberado han sido diseñadas para el diagnóstico de la infección tuberculosa, también pueden ser de utilidad en el diagnóstico de la tb activa. De este modo, se ha evaluado la cuantificación de la respuesta de las células t a los antígenos específicos de m. Tuberculosis, esat-6; cfp-10 y tb7.7, para poder diferenciar entre infección tuberculosa y tb activa en población adulta y pediátrica mediante las técnicas basadas en la detección de ifn-gamma. Y en segundo lugar, correlacionar esta respuesta cuantitativa de ifn-gamma con el inmunodiagnóstico de la tb, carga micobacteriana y enfermedad tuberculosa. la respuesta de ifn-g de las células t tras estimular con los antígenos esat-6, cfp-10 y rd1 fue mayor en los pacientes con tb activa. Nuestros resultados muestran que la respuesta al antígeno cfp-10 podría ser un marcador específico de tb activa. En nuestro estudio observamos que aunque existe solapamiento, un recuento de células t reactivas (tras estimular con los antígenos rd1 con la técnica de elispot) en pacientes con elevada sospecha clínica de tb por encima del punto de corte descrito, podría sugerir tb activa. El punto de corte propuesto es de 116 células, obteniendo una sensibilidad del 43% y una especificidad del 81%. para un mejor control de la expansión de la tb, es necesario identificar nuevos marcadores que nos permitan conocer mejor la respuesta del huésped contra m. Tuberculosis durante la enfermedad tuberculosa, y también durante el tratamiento. Recientemente, se han descrito unos nuevos péptidos rd1 seleccionados. Estos péptidos son una selección de los antígenos leucocitarios humanos de clase ii-rd1 restringidos de las proteínas esat-6 y cfp-10 de m. Tuberculosis y están asociados a la tb activa, y también a la respuesta al tratamiento antituberculoso. otro de los objetivos de esta tesis, fue determinar la respuesta de ifn-gamma de las células t sensibilizadas a los antígenos rd1 seleccionados, mediante una técnica de elispot experimental, en 29 y 24 pacientes con tb activa estudiados en el momento del diagnóstico y durante la terapia tuberculosa, comparando los resultados con el t-spot.Tb. en nuestro estudio observamos que el número de células t que responden a los antígenos seleccionados disminuye durante el tratamiento, es más, la conversión a resultados negativos es significativamente mayor para el elispot experimental con los antígenos rd1 seleccionados que para el t-spot.Tb. Nuestros resultados sugieren que estas técnicas inmunológicas basadas en antígenos seleccionados correlacionan con la carga bacteriana y posiblemente sean buenas herramientas para estudiar la respuesta inmunológica del huésped durante el tratamiento antituberculoso. por otro lado, la búsqueda y el estudio de nuevos biomarcadores, diferentes a la citoquina ifn-gamma, podrían permitir aumentar la sensibilidad de las técnicas in vitro para el diagnóstico de la infección tuberculosa. Se han estudiado un amplio rango de potenciales biomarcadores candidatos, de los cuales la ip-10 es el más prometedor. se determinó la sensibilidad y especificidad de una técnica de inmunodiagnóstico basada en la detección de ip-10, en 168 pacientes con tb activa confirmada y 101 controles sanos. En todos los pacientes se realizó qfn-g-it y detección de ip-10 por la técnica de luminex. Además, en un subgrupo de pacientes también se realizó la técnica de t-spot.Tb. en este estudio, hemos observado que la detección de la citoquina ip-10 por la técnica de luminex es comparable a la del ifn-gamma por las técnicas de qfn-g-it y t-spot.Tb. Además, se ha demostrado que con el uso combinado de ip-10 y qfn-g-it se puede conseguir un aumento de la sensibilidad en el diagnóstico de la tb activa, sin que la especificidad se vea alterada. en resumen, las técnicas basadas en la detección de ifn-gamma son más específicas que la pt, ya que están menos influenciadas por la vacuna de la bcg y la sensibilización a mnt. Por lo tanto, el uso de estas técnicas puede ayudar a reducir el número de quimioprofilaxis innecesarias en población adulta y pediátrica. La detección de ifn-gamma liberado por las células t sensibilizadas tras estimular con antígenos específicos de m. Tuberculosis es una herramienta diagnóstica alternativa en el diagnóstico de la infección tuberculosa en población inmunocompetente e inmunodeprimida. Además, estas técnicas in vitro pueden ayudar en el inmunodiagnóstico de la tb activa. Por otro lado, el estudio de nuevos antígenos específicos y biomarcadores es una herramienta potencial para el estudio de la respuesta del huésped contra m. Tuberculosis durante el tratamiento y la búsqueda de nuevos marcadores para el diagnóstico de la infección tuberculosa y tb activa.
Datos académicos de la tesis doctoral «Diagnóstico de la infección por mycobacterium tuberculosis mediante estimulación de las células t sensibilizadas con antígenos específicos.«
- Título de la tesis: Diagnóstico de la infección por mycobacterium tuberculosis mediante estimulación de las células t sensibilizadas con antígenos específicos.
- Autor: Irene Latorre Rueda
- Universidad: Autónoma de barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 15/04/2011
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Cristina Prat Aymerich
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Carlos rodrigo Gonzalo de liria
- christoph Lange (vocal)
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