Tesis doctoral de Patricia Elizaquível Bárcenas
La detección y cuantificación de microorganismos patógenos en alimentos es uno de los grandes retos a los que se enfrenta la industria alimentaria actualmente. Para ello, la aplicación de controles microbiológicos a lo largo de toda la cadena de procesado es imprescindible para minimizar riesgos y garantizar la calidad y seguridad de los productos. Los métodos tradicionales para la detección de patógenos en alimentos se basan en el aislamiento e identificación de colonias en medios selectivos tras uno o varios pasos de enriquecimiento lo que alarga el proceso y, en ocasiones, el resultado no es concluyente. Como alternativa destacan los métodos inmunológicos y los de pcr. Entre los primeros, el vidas® es uno de los más utilizados por las empresas de alimentos por su facilidad de ensayo. Por otra parte, las técnicas de pcr, constituyen una buena alternativa por su rapidez, sensibilidad y precisión. La pcr a tiempo real (rti-pcr), además, ofrece la posibilidad de cuantificar los microorganismos presentes en la muestra automatizando el proceso, lo que permite procesar un número elevado de muestras, reduciendo los problemas de contaminaciones posteriores. en este trabajo se ha aplicado la rti-pcr, para la detección de e. Coli o157:h7, l. Monocytogenes, salmonella spp. Y sta. Aureus, evaluándose asimismo su utilidad como prueba diagnóstica en el control microbiológico de alimentos. La comparación de cuatro métodos comerciales de extracción de dna, realizada en base a la sensibilidad en la detección por pcr, demostró que el método dneasy tissue kit es el más eficiente para la extracción de dna de los cuatro patógenos, en las tres matrices vegetales ensayadas. La aplicación directa de la rti-pcr en muestras de alimentos de contaminación natural permitió la cuantificación de los patógenos presentes en el 67 % de las muestras que habían resultado positivas por pcr convencional tras el enriquecimiento correspondiente, revelando que salmonella y e. Coli o157:h7 se encuentran generalmente en niveles de 1000 ufc/g, l. Monocytogenes de 100 ufc/g y sta. Aureus de 10 ufc/g. Las muestras restantes (33%) presentaron niveles inferiores a 10 ufc/g. La comparación de la rti-pcr directa y el procedimiento mini-vidas para la detección de e. Coli o157:h7, l. Monocytogenes y salmonella determinó que ambas técnicas presentan una especificidad similar pero la rti-pcr se comporta mejor en cuanto a «sensibilidad» y «seguridad» aún asumiendo que su aplicación directa, sin enriquecimiento, estará ofreciendo un resultado sesgado con posibles «falsos negativos». En base a estos resultados, se propone la utilización de la rti-pcr como técnica para rastrear la presencia de patógenos en el análisis rutinario de alimentos ya que ha demostrado ser una técnica rápida y sensible que permite completar el análisis en unas 5-6 horas, en lugar de las 24-72 horas que requiere el mini-vidas. Sólo las muestras negativas se analizarían por pcr, tras enriquecimiento, para asegurar la ausencia del patógeno. además, se diseñó un nuevo sistema de cebadores y sonda taqman para salmonella spp. Comprobándose su especificidad y sensibilidad en la detección en alimentos por rti-pcr. Combinando este sistema con los ensayados para e. Coli o157:h7 y sta. Aureus, se ha puesto a punto una reacción de rti-pcr múltiple para la detección simultánea y cuantitativa de los tres patógenos. La aplicación de la rti-pcr múltiple, tras un paso enriquecimiento de tan sólo 6 horas permite la detección de hasta 1 célula de cada uno de los patógenos en 25 g. Por lo tanto, queda demostrada su validez como técnica analítica cuando la legislación exige «ausencia» del patógeno en 25 g, como es el caso de salmonella y e. Coli o157:h7 o de sta. Aureus en algunos alimentos.
Datos académicos de la tesis doctoral «Detección y cuantificación de escherichia coli o157:h7, listeria monocytogenes, salmonella spp. y staphylococcus aureus en alimentos vegetales mediante pcr a tiempo real«
- Título de la tesis: Detección y cuantificación de escherichia coli o157:h7, listeria monocytogenes, salmonella spp. y staphylococcus aureus en alimentos vegetales mediante pcr a tiempo real
- Autor: Patricia Elizaquível Bárcenas
- Universidad: Universitat de valéncia (estudi general)
- Fecha de lectura de la tesis: 06/03/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Rosa Aznar Novella
- Tribunal
- Presidente del tribunal: javier Hernández haba
- david Rodriguez lazaro (vocal)
- María José Ocio zapata (vocal)
- teresa Aymerich calvet (vocal)