Tesis doctoral de Isabel María Matas Casado
Título de la tesis: genómica funcional de la interacción pseudomonas savastanoi pv. Savastanoi – olivo resumen: los procesos moleculares responsables de la interacción entre la bacteria causante de la tuberculosis del olivo, pseudomonas savastanoi pv. Savastanoi (psv), y su planta huésped, olea europaea l, son prácticamente desconocidos. Tras la penetración de psv en los tejidos vegetales a través de heridas, la multiplicación del patógeno desencadena una hipertrofia e hiperplasia de los mismos y, en consecuencia, la formación de tumores. En este trabajo se planteó como objetivo principal la identificación de genes implicados en la virulencia y supervivencia de p. Savastanoi pv. Savastanoi en un huésped leñoso, el olivo. el análisis bioinformático de la secuencia del genoma de la cepa de referencia psv ncppb 3335, con 5232 regiones codificantes predichas, un tamaño total de 5.85 mb y un 57.12% g+c, reveló una elevada conservación con los genomas de pseudomonas syringae pv. Phaseolicola 1448a y p. Syringae pv. Tabaci 11528. El análisis comparativo de la secuencia del genoma de psv con el de los siete genomas secuenciados del complejo p. Syringae ha permitido caracterizar tanto los factores de virulencia conservados en este complejo bacteriano, como aquellos presentes únicamente en algunos patovares y que podrían determinar la especificidad de hospedador. Psv ncppb 3335 contiene doce regiones genómicas variables, mayores de 10kb, que están ausentes en las cepas del complejo p. Syringae secuenciadas, asi como 71 genes específicos de esta cepa. Entre los posibles factores de virulencia identificados, cabe destacar la existencia de una gran variedad de transportadores y rutas catabólicas posiblemente implicadas en la degradación de compuestos aromáticos de origen vegetal, asi como la duplicación de secuencias relacionadas con la biosíntesis de la fitohormona ácido indolacético. La búsqueda bioinformática de efectores del sistema de secreción tipo iii (t3es) en psv reveló la existencia de 34 genes candidatos a t3es. Con el fin de determinar la validez de la predicción bioinformática llevada a cabo, se seleccionaron 6 t3es candidatos a los que se probó su translocación a través del sistema de secreción tipo iii (t3ss) utilizando un ensayo basado en la actividad adenilato ciclasa (cya). Los resultados obtenidos indican que 5 de estíos 6 t3es se translocan a través del t3ss de este patógeno. De entre ellos, psva-1, psva-2 y hp-1017 se revelan como nuevos t3es dentro de complejo p. Syringae. en este trabajo se ha utilizado una estrategia de genómica funcional, signatura tagged mutagenesis (stm), para la identificación de genes de psv necesarios para su multiplicación e invasión del hospedador. Se construyó una colección de 4778 mutantes stm de la cepa de referencia psv ncppb 3335, cada uno de los cuales contienen un transposón min¡-tn5-km2 portador de una etiqueta diferente (región variable de 40 pb). El análisis en masa de los mutantes, en grupos de aproximadamente 45, se realizó en plantas de olivo cultivadas in vhro. Treinta días después de la infección, las etiquetas correspondientes a los mutantes cuya multiplicación in planta se encuentra reducida no se detectan mediante hibridación southern. Se han seleccionado 73 mutantes cuyas etiquetas no fueron detectadas, que presentan una única inserción del transposón en su genoma y cuya competitrvidad se encuentra significativamente reducida únicamente in planta. La identificación del punto de inserción del transposón ha revelado la identidad del gen interrumpido en todos estos mutantes. Los genes identificados se agrupan en siete categorías funcionales: 1) metabolismo central; 2) sistemas de secreción; 3) mantenimiento y envuelta celular; 4) tolerancia a estrés y adaptación ambiental; 5) proteínas relacionadas con dna; 6) proteínas hipotéticas, y; 7) mutantes en genes que codifican proteínas con funciones diversas no relacionadas con las categorías anteriores. Tras determinar el papel en virulencia de la mayoría de los genes identificados realizando inoculaciones individuales en plantas de olivo leñosas, se analizó la estructural tumoral y la localización de células bacterianas, marcadas con gfp, en tumores de olivo in vhro inducidos por al menos un mutante perteneciente a cada una de las categorías anteriores. De este trabajo se concluyó que la multiplicación y persistencia de psv en los tejidos de olivo es dependiente de la biosíntesis de al menos 9 de los 20 aminoácidos comunes que constituyen las proteínas, asi como de la biosíntesis de las vitaminas biotina, cobalamina y tiamina, y de 3 genes posiblemente implicados en el transporte de citrato, glutamato y sulfato. Además, la virulencia de psv en olivo es dependiente, entre otros factores, de la biosíntesis de ácido indol-3-acético, de la integridad de los sistemas de secreción tipo ii, iii y iv, asi como de la de genes posiblemente implicados en la detoxificación de especies reactivas de oxigeno (mrsa, pqib y rubb), en la fluidez de membrana y en la biosíntesis de peptidoglicano y exopolisacáridos.
Datos académicos de la tesis doctoral «Genomica funcional de la interaccion pseudomonas savastanoi pv savastanoi-olivo«
- Título de la tesis: Genomica funcional de la interaccion pseudomonas savastanoi pv savastanoi-olivo
- Autor: Isabel María Matas Casado
- Universidad: Málaga
- Fecha de lectura de la tesis: 10/12/2010
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Cayo Juan Ramos Rodriguez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Antonio De vicente moreno
- Francisco m. Cazorla lopez (vocal)
- María isabel Ramos gonzález (vocal)
- Jesús Mercado blanco (vocal)