Tesis doctoral de Juan Luis Garcia Rodriguez
El hígado es por excelencia el órgano metabólico del cuerpo humano. La acumulación de grasa en los hepatocitos debido a diferentes factores de riesgo como la obesidad, la resistencia a insulina, dislipemia o hipertensión, es llamada esteatohepatitis no alcohólica (ehna). Ehna es una de las principales enfermedades del hígado en los países desarrollados y la enfermedad hepática crónica es una de las principales causas de mortalidad. Los pacientes con ehna pueden llegar a desarrollar carcinoma hepatocelular (chc).El chc es la tercera causa de muerte por cáncer en el mundo y es el cáncer con mayor preValencia en la población incluso en países desarrollados. La etiología es heterogénea y las principales causas son el alcoholismo, la aflatoxina b y la infección por el virus de la hepatitis b o c. El chc tiene un mal pronóstico debido a la ausencia de síntomas en los primeros estadíos de la enfermedad. Como consecuencia, la patología se detecta en estado avanzado, lo que recorta el rango de terapias curativas. El estrés oxidativo, la homeostasis de ácidos biliares, el metabolismo de la metionina o un p53 dañado, entre otros factores moleculares, están involucrados en su progresión. En particular, el metabolismo de la metionina y los niveles de s-adenosilmetionina (same) no son correctos en pacientes humanos con cirrosis y alto riesgo de desarrollo de chc.Same es el principal metabolito responsable de la homeostasis del hígado y principal donador de grupos metilo en la célula. Same participa de manera crucial en la proliferación hepática, diferenciación y apoptosis. Por ello, es necesario un correcto balance de same para la funcionalidad normal del hígado. Same es capaz de inhibir la activación de la ruta de proliferación no canónica lkb1/ampk/enos en la regeneración hepática.Lkb1 es deacetilada por sirt1, este evento promueve su translocación nucleo-citoplásmica y su consiguiente incremento de la actividad catalítica. Sirt1 se expresa ampliamente, es una histona deacetilasa de clase iii que regula una gran variedad de funciones, pasando por el estrés celular hasta el metabolismo energético. Es más, sirt1 regula íntimamente el metabolismo de lípidos, glúcidos y ácidos biliares. Sirt1 se activa en situaciones de baja disposición de energía y enlaza el estatus nutricional con la homeostasis metabólica.Una parte de esta tesis describe cómo sirt1 controla la respuesta regenerativa del hígado. Ratones transgénicos que sobreexpresan sirt1 mostraron un incremento en la mortalidad, una proliferación hepática dañada, acumulación de ácidos biliares y una marcada lesión hepática tras hepatectomía parcial. Este fenotipo lesivo de los ratones sirt1 se correlacionó con una desregulación de la actividad de fxr debido a cambios en los procesos de acetilación/deacetilación. Nuestros datos aportan nuevas evidencias de los mecanismos moleculares que median los efectos positivos del ácido 24-norursodeoxicólico (norudca) en la regeneración hepática. Además, describimos la existencia de una relación directa entre mtor y el metabolismo de ácidos biliares, ya que mtor muestra la capacidad de regular los procesos de acetilación mediante el control de sirt1.Como añadido, exploramos el rol de sirt1 en la tumorogénesis que aún sigue en controversia. Encontramos que en muestras de chc humanas hay un incremento de sirt1, lo que sugiere su potencial oncogénico. Con ello, proponemos que sirt1 contribuye en la génesis tumoral a través de la desregulación de la homeostasis de ácidos biliares como consecuencia de la persistente deacetilación de fxr. En global, definimos sirt1 como un regulador clave de la respuesta regeneradora en el hígado a través de modificaciones postraduccionales que regulan la actividad de fxr, histonas y mtor.Mat1a es uno de las dos enzimas adenosiltransferasas de la metionina involucradas en la síntesis de same y, por su parte, gnmt es la principal enzima responsable de su catabolismo. Tanto la deficiencia de mat1a como la de gnmt han sido encontradas en la mayoría de hígados cirróticos en humanos, en algunas lesiones preneoplásicas y en chc. Por esta razón, nuestro laboratorio en pos de elucidar los mecanismos derivados de la enfermedad hepática derivada de este desajuste de los niveles de same, creó dos modelos de ratón knock-out (ko): el ratón mat1a-ko y el ratón gnmt-ko, ambos caracterizados por la ausencia crónica de same o su exceso crónico, respectivamente. Los dos modelos desarrollan espontáneamente lesión hepática y chc.La delección de mat1a induce el descenso de same hepático, la activación de la lipogénesis, inhibición del uso de triglicéridos (tg) y esteatosis. Los bajos niveles de same afectan al normal ensamblaje de las vldl y a la homeostasis de los niveles de lípidos en plasma lo que contribuye al desarrollo de ehna. La fosfatidilcolina (pc) hepática es necesaria para mantener este balance. Cuando la síntesis de pc no es la adecuada los tg se acumulan en el hígado. Del mismo modo, la ausencia crónica de gnmt incrementa el contenido hepático de same pero también desarrolla esteatosis ya que el exceso de same reorienta a la fosfatidiletanolamina (pe) a través de la pc lo que lleva al incremento de síntesis de tg y secuestro de lípidos. En esta tesis se propone que debido a que la metionina y su metabolito same son conocidos inactivadores de la autofagia, los altos niveles de ambos puede contribuir al desarrollo de esteatosis mediante el bloqueo del catabolismo lipídico causado por el propio bloqueo de la autofagia. Los análisis in vitro e in vivo mostraron que la lipofagia en el hígado se veía afectada por la presencia de altos niveles de metionina y same, estos dos factores al mismo tiempo previnieron la basificación del ph intracelular que es necesario para el posicionamiento perinuclear de los lisosomas y, además, inhibían la actividad de mtor que es muy importante en la terminación de la autofagia y la reformación del lisosoma mediada por la metilación de la fosfatasa pp2a. Pp2a activada incrementó la actividad de la via camp/pka lo que contribuye a la localización periférica del lisosoma. Todos estos datos resuelven un nuevo mecanismo en la patogénesis de la esteatosis hepática, donde los altos niveles de metionina junto con su metabolito same inhiben el catabolismo lipídico mediado por el bloqueo de la autofagia, modulando la actividad intracelular de pp2a y la localización lisosomal. El último paso en la degeneración del hígado es el chc y ambos modelos, mat1a-ko y gnmt-ko terminan con el desarrollo espontáneo de chc. Las células tumorales del mat1a-ko están caracterizadas por la regulación de una de las rutas principales de la célula, akt, de un modo dependiente de lkb1. Además, lkb1 actúa como un máster-regulador de la localización de dos dianas apoptóticas como son p53 y hur. Otra parte de esta tesis muestra los mecanismos involucrados en las células de hepatoma de gnmt-ko, llamadas células oker, donde los altos niveles de same promueven la hiperactivación de la ruta de ras gracias al silenciamiento por metilación en las regiones promotoras de los inhibidores de ras. Estas células de hepatoma sin gnmt están caracterizadas por la hiperfosforilación y altos niveles de lkb1 y el desacople del eje lkb1/ampk. Además, rasgrp3 es esencial en la activación de ras y lkb1 es quien se encarga de la inducción de la primera. Se realizó un modelo xenograft de ratón nude con las células oker donde se reveló que el silenciamiento de lkb1 downregulaba la actividad de ras reprimiendo el crecimiento de estos tumores. Nuestros resultados resaltan la importancia de lkb1 en chc y el eje lkb1/rasgrp3/ras en el cáncer de hígado humano y remarcan la inversa correlación entre la ausencia de gnmt y los altos niveles de lkb1 en favor de la transformación maligna.Como se ha mencionado, lkb1 es crucial en la adecuada regeneración del hígado y su proliferación. Además, en los tumores sin mat1a ni gnmt, la activación de lkb1 correlaciona con su nivel de proliferación y el aumento en los niveles del gen de lkb1 (stk11) coincide con el mal pronóstico de chc. Sin embargo, los mecanismos exactos por los cuales lkb1 se acumula aún no han sido determinados. Aquí presentamos resultados mostrando que la neddilización estabiliza los niveles proteicos de lkb1. La neddilización es un proceso implicado en la proliferación celular, diferenciación, supervivencia, metabolismo y estabilización de importantes proteínas en cáncer como es hur. De hecho, trabajos recientes realizados en nuestro laboratorio, describieron la neddilización como marcador de pobre supervivencia para pacientes con chc y se postuló como una diana terapéutica para tumores de hígado positivos en nedd8. En global, los datos confirmaron la implicación de la maquinaria de nedd8 en el control de la estabilidad de lkb1. Estos resultados revelaron una completa nueva visión de un panorama aun inexplorado: la neddilización en el desarrollo de cáncer de hígado.Finalmente, continuamos estudiando los efectos mecanísticos que la abundancia de lkb1 conlleva en el hígado y en células humanas de hepatoma. Nuestros datos colocan a lkb1 como un regulador con un rango de acción aún mayor del descrito históricamente, actuando no sólo como un activador de ampk controlando los niveles bajos de energía o la polaridad celular, sino también promoviendo la proliferación y la viabilidad celular de una manera dependiente de ras y su activador rasgrp3. Lkb1 actúa como guía oncogénica en chc a tres niveles diferentes: i) como quinasa interaccionando y consiguientemente activando rasgrp3 lo que promueve la proliferación mediada por ras; ii) como factor de transcripción, uniéndose a ncor1 y de esta manera regulando la actividad deacetilasa de hdac3 y hdac4, promoviendo un estado abierto de las histonas lo que podría apoyar la malignidad; y iii) como regulador metabólico en células de hepatoma, conduciendo todos los aportes energéticos hacia la proliferación. En el hígado, nuestros resultados subrayan que los altos niveles de lkb1 afectan a su homeostasis causando daño hepático. Lkb1 activa metabólicamente las células tumorales promoviendo la fosforilación oxidativa, la glicólisis, el uso de glutamina como fuel y afectando a la homeostasis lipídica, todo ello como pro-activador de la expresión y traducción proteica. En resumen, un exceso de lkb1 causa lesión hepática lo que ubica a lkb1 en una posición crucial en la fisiología hepática, afectando a la degeneración hacia chc, lo que recalca a lkb1 como un conductor proliferativo en tumores hepáticos y un interesante marcador de chc. Nuestros resultados revelan nuevas rutas de señalización moleculares implicadas en la patología hepática principalmente enfocados en ehna, metabolismo de ácidos biliares y cáncer de hígado en esta tesis. Se ha descifrado el rol de sirt1 como regulador de la respuesta regenerativa en el hígado. Se ha definido un nuevo mecanismo en la patogénesis de la esteatosis hepática, donde elevados niveles de metionina y same inhiben el catabolismo lipídico mediante el bloqueo de la autofagia. Además se ensalza la importancia de lkb1 en el chc y el eje lkb1/rasgrp3/ras en un contexto sin gnmt en cáncer hepático y se explica cómo la neddilización está implicada en la estabilidad de lkb1 lo que abre una nueva visión en el desarrollo del cáncer de hígado finalmente, se resalta a lkb1 como proteína clave en la fisiología hepática y como conductor en la proliferación del chc.
Datos académicos de la tesis doctoral «Lkb1 in liver physiology«
- Título de la tesis: Lkb1 in liver physiology
- Autor: Juan Luis Garcia Rodriguez
- Universidad: País vasco/euskal herriko unibertsitatea
- Fecha de lectura de la tesis: 31/01/2014
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Mª Luz Martinez Chantar
- Tribunal
- Presidente del tribunal: María isabel Fabregat romero
- arkaitz Carracedo pérez (vocal)
- patrizia Pontisso — (vocal)
- matías Antonio ávila zaragozá (vocal)