Tesis doctoral de María Victoria Moneo Ocaña
Agradecimientos……………………………………………………………………………………………Ix índice …………………………………………………………………………………………………………….Xiii resumen………………………………………………………………………………………………………. Xvii summary………………………………………………………………………………………………………. Xxi abreviaturas ………………………………………………………………………………………………. Xxv 1 introducción……………………………………………………………………………………………. 1 1.1 necesidad de nuevas opciones terapéuticas…………………………………………….. 3 1.2 la célula como modelo ………………………………………………………………………….. 4 1.2.1 biología de la célula en cultivo …………………………………………………………. 5 1.2.2 cultivos celulares continuos…………………………………………………………….. 7 1.3 sarcomas……………………………………………………………………………………………. 10 1.3.1 alteraciones cromosómicas en sarcomas. ……………………………………….. 12 1.3.2 alteraciones moleculares en sarcomas……………………………………………. 13 1.4 fármacos antineoplásicos…………………………………………………………………….. 17 1.4.1 quimioterápicos de origen natural …………………………………………………. 18 1.4.2 anti-tumorales según su mecacnismo de acción………………………………. 20 2 objetivos…………………………………………………………………………………………………. 25 3 materiales y métodos ……………………………………………………………………………. 29 3.1 muestras para el procesamiento en cultivos. …………………………………………. 31 3.2 material de cultivo celular: soportes, sustratos, medios, sueros y aditivos. .. 31 3.3 técnica de cultivo celular……………………………………………………………………… 32 3.3.1 mantenimiento y conservación de los cultivos…………………………………. 33 3.4 análisis citogenético. …………………………………………………………………………… 33 3.5 inmunofenotipaje. ………………………………………………………………………………. 33 3.6 análisis de los niveles de proteínas. ………………………………………………………. 34 3.6.1 obtención de extractos proteicos. ………………………………………………….. 34 3.6.2 western blot………………………………………………………………………………… 35 3.6.3 inmunoprecipitación. ……………………………………………………………………. 35 3.7 técnicas de análisis de expresión a nivel de arn…………………………………….. 36 3.7.1 obtención de arn total…………………………………………………………………. 36 3.7.2 transcripción reversa (rt)……………………………………………………………… 36 3.7.3 reacción en cadena de la polimerasa (pcr)……………………………………… 37 3.7.4 determinación de la secuencia de p53. …………………………………………… 37 3.8 ensayos para analizar los efectos celulares de los antitumorales………………. 39 3.8.1 citotoxicidad: mtt y cristal violeta. ……………………………………………….. 39 3.8.2 análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo……………………….. 39 3.8.3 doble tinción con yoduro de propidio y anexina. ……………………………… 40 3.8.4 núcleos apoptóticos. …………………………………………………………………….. 40 3.8.5 ensayo clonogénico. ……………………………………………………………………… 40 3.9 transfecciones. …………………………………………………………………………………… 41 3.9.1 método del fosfato cálcico. ……………………………………………………………. 41 indice xvi 3.9.2 arn de interferencia para p27kip1…………………………………………………….41 3.9.3 infección retroviral…………………………………………………………………………41 3.10 ensayos en ratones desnudos ………………………………………………………………..42 4 resultados……………………………………………………………………………………………….43 4.1 generación de herramientas para estudiar la respuesta a tratamientos quimioterápicos…………………………………………………………………………………………..45 4.1.1 establecimiento de líneas celulares. …………………………………………………46 4.1.2 inmortalización de células epiteliales de mama y ovario procedentes de mujeres portadoras de mutaciones en el gen brca. …………………………………..51 4.1.3 selección de poblaciones celulares…………………………………………………..53 4.1.4 capacidad tumorigénica in vivo. ………………………………………………………58 4.2 panel de líneas celulares de sarcoma………………………………………………………60 4.2.1 caracterización citogenética. …………………………………………………………..61 4.2.2 caracterización molecular……………………………………………………………….64 4.2.3 caracterización farmacológica de las líneas de sarcoma……………………..71 4.3 análisis de determinantes de sensibilidad a fármacos ………………………………74 4.4 la sensibilidad a yondelis correlaciona con la funcionalidad de p53 ……….84 4.4.1 ensayos de citotoxicidad …………………………………………………………………84 4.4.2 evaluación del estatus de p53………………………………………………………….86 4.5 los niveles de p27kip1 determinan la sensibilidad a aplidina ……………………90 4.5.1 respuesta a aplidina de las líneas de sarcoma………………………………..90 4.5.2 la ausencia de p27kip1 incrementa la sensibilidad a aplidina en fibroblastos embrionarios murinos. ………………………………………………………….93 4.5.3 relación funcional entre los niveles de p27kip1 y respuesta a aplidina . 95
Datos académicos de la tesis doctoral «Generacion de herramientas celulares para validación preclínica de compuestos antitumorales«
- Título de la tesis: Generacion de herramientas celulares para validación preclínica de compuestos antitumorales
- Autor: María Victoria Moneo Ocaña
- Universidad: Autónoma de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 23/10/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Javier Benítez Ortiz
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Marta Izquierdo rojo
- Juan Carlos Tercero lopez (vocal)
- Luis Francisco Garcia fernandez (vocal)
- m. isabel Sanchez perez (vocal)