Tesis doctoral de Valentin Cabañas Perianes
Abstract objectives: osteoporosis is a skeletal disease characterized by systemic bone loss with an increased risk to bone fractures, associated with high morbidity and mortality. Mesenchymal stem cells (msc) from bone marrow (bm) are ideal candidates for the treatment of osteoporosis because they are able to differentiate to osteoblasts. Although bone graft of mscs has been demonstrated, its osteotropism is low when they are administered intravenously (iv), of choice in this multifocal disease. Msc homing depends upon the adhesive interaction between msc surface receptors and counter receptors on endothelial cells. E-selectin protein is induced on microvascular endothelium in inflammatory tissues in response to cytokines and it is constitutively expressed in bm endothelial cells. The hematopoietic cell e and l-selectin ligand (hcell), a glycoform of cd44, is a potent e-selectin ligand expressed constitutively in the hematopoietic stem cells (hsc). Hcell represents the key to involve in cell recruitment to the bm. Msc express cd44 but do not express hcell or other e-selectin ligands. Ex vivo fucosylation (adding a fucose residue) in ?1-3 position of the cd44 antigen by use of the enzyme fucosyltransferase vi (ftvi) yields hcell in msc increasing the affinity for e-selectin and osteotropism. The aim of this preclinical study was to describe the safety and efficacy of human fucosylated msc infused in an immunocompromised mice model (nod/scid). Methods: 31 nod/scid mice were randomized to by tail vein injection: 1×106 fucosylated msc (n=13), 1×106 msc (n=14) or saline (n=4). Toxicities were evaluated by a clinical score, weight and histological assessment (heart, lung, liver, spleen, kidney, gonads, brain, bone and bm). Rt-pcr array-based evaluation of the expression of human ?-Actin and ?2-microglobulin genes was performed to study biodistribution of msc. The maintenance of genetic integrity was evaluated during in vitro culture by karyotype. Additional samples of tibia and calota were to immunostained with a polyclonal rabbit anti-human osteocalcina to demonstrate efficacy. Osteocalcin-positive cells were identified by a dark-brown cytoplasmic precipitate. Results: there was no unexpected death and none of the mices had any acute toxicity. One mouse in the saline arm had mild chronic toxicity primarily manifested as piloerection, and moderate changes in behavior. The histology of heart, liver, kidney, spleen, gonads, brain, bone and bone marrow was normal in all mice. There were localized areas of lung inflammation in 15%, 42% and 25% of mice infused with fucosylated msc, msc, and saline, respectively without significance differences (p=0.28). Biodistribution was normal with except one mice (infused with msc non-fucosylated) showed an expression of human rna ?-Actin and ?2-microglobulin in the lung sample taken after 12 weeks of intravenous infusion .Osteoblasts were seen in 100% of mices infused with fucosylated msc, in 62.5%% of animals infused with msc alone, and none in saline group (p=0.01). Nod/scid mice infused with fucosylated msc presented a higher number of osteoblasts positive for osteocalcin in 10 high-power fields (400x) of tibia and calvarium sections that non-fucosylated (32 vs 5.5) (p=0.0082). Human osteoblasts were detected inside the bone from the fifth to the twelfth week after infusion. Conclusions: our preclinical trial demonstrate that the intravenous infusion of human fucosylated msc is safe and effective in guiding the cells to bone with a higher potential to ossification in nod/scid mices that non-fucosylated msc. These results are allowing to start a human clinical trial with intravenous fucosylated msc as treatment in patients with osteoporosis. resumen: objetivos: la osteoporosis es una enfermedad ósea definida por la pérdida de masa ósea generalizada con un elevado riesgo de fracturas óseas asociado a una alta morbimortalidad. Las células stem mesenquimales (csm) de médula ósea (mo) pueden representar un tratamiento óptimo para la osteoporosis debido a su capacidad innata de diferenciación a osteoblastos. Aunque el injerto de las csm ha sido demostrado, su tropismo óseo es bajo cuando se administran de forma intravenosa, imprescindible para el tratamiento de esta enfermedad sistémica. Su tropismo depende de la interacción de sus receptores de superficie con los que se encuentran en las células endoteliales. La proteína e-selectina es inducida en el endotelio de la microvasculatura de tejidos inflamatorios en respuesta a citoquinas y es constitutivamente expresada en las células endoteliales de mo. La glicoforma de cd44 (hcell), un potente ligando de e y l-selectina, es expresada de forma innata por las células stem hematopoyéticas (csh). Hcell es la molécula clave para el reclutamiento celular hacia la mo. Las csm expresan cd44 pero no hcell ni otros ligandos de e-selectina de forma constitutiva. La fucosilación (adición de una fucosa) ex vivo en posición ?1,3 del antígeno cd44 mediante la enzima fucosiltransferasa vi (ftvi) produce hcell en las csm, incrementando su afinidad por e-selectina y por tanto su osteotropismo. El objetivo de este estudio preclínico es evaluar la seguridad y la eficacia de las csm humanas fucosiladas en un modelo murino inmunocomprometido (nod/scid). Métodos: 31 ratones nod/scid fueron randomizados a recibir de forma intravenosa: 1×106 csm fucosiladas (n=13), 1×106 csm (n=14), o salino (n=4). Las toxicidades fueron evaluadas por un score clínico, peso y un examen histológico (corazón, pulmón, hígado, bazo, riñón, gónadas, cerebro, hueso y mo). Se realizó estudio de biodistribución mediante detección de los genes ?-Actina y ?2-microglobulina humanas. La integridad genética fue evaluada por cariotipo. Se realizó inmunohistoquímica con un anticuerpo policlonal anti-osteocalcina humana para valorar eficacia. Las células osteocalcina positivas fueron identificadas por un precipitado citoplasmático de color marrón oscuro. Resultados: no se produjo ningún fallecimiento inesperado y ningún ratón mostró toxicidad aguda. Un ratón en el brazo de salino presentó toxicidad crónica leve (piloerección y cambios moderados en el comportamiento). La histología de corazón, hígado, bazo, riñón, cerebro, hueso y mo fue normal en todos los ratones. Se objetivaron áreas localizadas inflamatorias en los pulmones de un 15%, 42% y 25% de los ratones infundidos con csm fucosiladas, csm y salino respectivamente sin diferencias significativas (p=0.28). La biodistribución fue normal en todos los ratones con la excepción de un ratón (infundido con csm sin fucosilar) que mostró expresión de arn humano (?-Actina and ?2-microglobulina) en la muestra pulmonar tomada a las 12 semanas después de la infusión. Se observaron osteoblastos en el 100% de los ratones infundidos con csm fucosiladas, en 62,5% de los infundidos con csm, y ninguno en el grupo de salino (p=0.01). Los ratones infundidos con csm fucosiladas presentaron un mayor número de osteoblastos osteocalcina positivos en 10 campos de gran aumento (400x) de secciones de tibia y calota con respecto a los infundidos con no fucosiladas (32 vs 5.5) (p=0.0082). Las csm fucosiladas. Los osteoblastos humanos fueron detectados en el hueso desde la quinta a la doceava semana post-infusión. Conclusiones: nuestro ensayo preclínico demuestra que la infusión intravenosa de csm fucosiladas es segura y eficaz en guiar las células al hueso con un potencial más elevado de osificación en ratones nod/scid que las csm no fucosiladas. Estos resultados van a permitir comenzar con un ensayo clínico en humanos con csm fucosiladas.
Datos académicos de la tesis doctoral «Trasplante de células mensequimales fucosiladas en el tratamiento de la osteoporosis. estudio preclínico y prueba de concepto«
- Título de la tesis: Trasplante de células mensequimales fucosiladas en el tratamiento de la osteoporosis. estudio preclínico y prueba de concepto
- Autor: Valentin Cabañas Perianes
- Universidad: Murcia
- Fecha de lectura de la tesis: 06/06/2014
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Ana María Garcia Hernandez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Juan jose Lahuerta palacios
- Majado martínez m. juliana (vocal)
- fermin Sanchez-guijo martin (vocal)
- Luis Francisco Linares ferrando (vocal)