Tesis doctoral de María Eugenia Martínez Peláez
Se llevaron a cabo varios experimentos con fermentadores rusitec y uno con cultivos discontinuos de microorganismos ruminales (bcrm) con el fin de analizar los efectos de diferentes factores en la fermentación ruminal in vitro. inicialmente se efectuó una prueba de 14 días de duración (prueba 1) utilizando 16 fermentadores rusitec para investigar la evolución de los parámetros fermentativos a lo largo del período de incubación cuando los fermentadores se manejaban con diferentes ritmos de dilución (dl) y tiempos de retención (rt) del concentrado. Los fermentadores recibieron una dieta consistente en heno de alfalfa y concentrado en proporciones 30:70, y los dl fueron 3,78 (ldl) y 5,42%/h (hdl). El rt del concentrado fue de 24 (t24) o 48 h (t48), y el rt del forraje fue de 48 h en todos los fermentadores. Se observaron interacciones significativas del día de incubación con el dl y con el rt (p < 0,05) en todos los parámetros medidos, con la excepción de las proporciones molares de acético. En general, los fermentadores sometidos a un mayor ritmo de dilución se estabilizaron antes que los manejados con el menor ritmo de dilución, y se consideró que, bajo las condiciones de este estudio, fueron suficientes 6 días para alcanzar valores estables en la mayoría de los parámetros medidos. el objetivo de la prueba 2 fue investigar la evolución de las comunidades de protozoos a lo largo de 14 días en 16 fermentadores rusitec que recibían 4 dietas diferentes. Las dietas tenían relaciones forraje:concentrado (f:c) de 70:30 (hf) o 30:70 (hc), con heno de alfalfa (a) o de gramíneas (g) como forraje. Se utilizó fluido ruminal procedente de ovejas que recibían las mismas dietas para inocular los fermentadores el día 0. El rt del forraje y el concentrado fue de 48 y 24 h, respectivamente, y el dl fue de 5,14%/h. El número total de protozoos disminuyó muy rápido a partir del primer día tras la inoculación, pero se mantuvieron protozoos hasta el último día en todos los fermentadores, en concentraciones que oscilaron entre 3,30 a 8,52 x 103/ml. Sólo los entodiniinae fueron capaces de permanecer en los fermentadores que recibieron las dietas hc al final de la prueba, pero los entodiniinae, isotrichidae y diplodiniinae fueron capaces de permanecer en los fermentadores que recibían las dietas hf hasta el último día. Los ophryoscolecinae desaparecieron totalmente de todos los fermentadores el sexto día de la incubación. En general, se observaron más protozoos en los fermentadores alimentados con las dietas que contenían heno de gramíneas en comparación con los que recibían dietas con heno de alfalfa. Los resultados indicaron que no fue posible mantener comunidades protozoarias similares a las presentes en el momento de la inoculación y que la dieta administrada a los fermentadores afectó a la supervivencia de los grupos. el objetivo de la prueba 3 fue investigar los efectos de dos dl y dos rt del concentrado en el crecimiento microbiano, la producción de metano y la fermentación de una dieta consistente en heno de alfalfa:concentrado en proporción de 30:70 administrada a fermentadores rusitec mantenidos a un ph similar. Los dl fueron de 3,78 (baja; ldl) o 5,42%/h (alta; hdl), y el rt del concentrado fue de 24 (t24) o 48 h (t48). El rt del forraje fue de 48 h en todos los fermentadores. La desaparición aparente de la dieta fue mayor en los fermentadores hdl comparados con los ldl, aunque el efecto del ldl fue más pronunciado en los t48 comparados con los t24. El dl no afectó a la producción de metano, pero esta producción fue mayor en los fermentadores t48 comparados con los t24. El incremento en el dl aumentó la producción de ácidos grasos volátiles (vfa) y las proporciones molares de propiónico, isovalérico y valérico, y redujo las de caproico. El aumento en el rt del concentrado resultó en una mayor producción de vfa y mayores proporciones de acético, butírico y caproico, pero redujo las proporciones de propiónico, valérico e isovalérico. La producción de n amoniacal no se vio afectada por el rt del concentrado, pero fue mayor en los fermentadores hdl comparados con los ldl. El dl no afectó al crecimiento microbiano, pero la eficiencia de síntesis fue menor en los fermentadores hdl comparados con los ldl. El crecimiento microbiano, así como su eficiencia, fueron mayores en los fermentadores t48 comparados con los t24. Los resultados parecen indicar que utilizar dl más altos y rt del concentrado más cortos que los habitualmente utilizados en fermentadores rusitec podría contribuir a mejorar la simulación de la fermentación in vivo de dietas con una alta proporción de concentrados. en la prueba 4 se evaluó la eficacia de tres procedimientos de desligamiento (dp) para desligar las bacterias asociadas a la fase sólida (sab) de la digesta en fermentadores rusitec que recibían una dieta consistente en heno de alfalfa y concentrado en proporciones de 30:70. El forraje y el concentrado se incubaron en bolsas de nailon separadas y los residuos de incubación se trataron independientemente. la biomasa bacteriana se marcó con 15nh4cl. Los tratamientos fueron: 1) met: se incubaron los residuos a 38°c durante 15 minutos con solución salina (0,9% nacl) que contenía un 0,1% de metilcelulosa, en agitación continua; 2) sto: los residuos se mezclaron con solución salina fría y se homogeneizaron en un stomacher durante 5 minutos a 230 revoluciones por minuto; y 3) fre: los residuos se congelaron inmediatamente a menos 20°c durante 72 h, se descongelaron a 4°c, se mezclaron con solución salina y se sometieron al tratamiento sto. Un procedimiento común a los tres dp fue almacenar los residuos a 4°c durante 24 h tras el tratamiento, seguido de un homogeneizado, filtrado y resuspensión de los residuos dos veces en la solución correspondiente al tratamiento. Los pellets bacterianos se obtuvieron por centrifugación, y el desligamiento se estimó indirectamente midiendo la eliminación del 15n. Para analizar la similitud entre las comunidades bacterianas ligadas al sustrato y las presentes en los pellets tras el dp correspondiente se utilizó el análisis de polimorfismos de conformación de cadena simple (sscp). La eficiencia del desligamiento y la recuperación total de las sab desligadas se vieron significativamente afectadas por el dp, siendo sto el tratamiento que mostró los mayores valores (64,1% de eficiencia del desligamiento y 58,3% de recuperación total) y met los menores (57,0 y 51,8%). El dp también afectó al índice de similitud entre las sab ligadas a los sustratos y las de los pellets, con mayores valores para el tratamiento met (84,0 y 86,4% para forraje y concentrado, respectivamente) que para fre (72,5 y 67,8%) y para sto, que mostró valores intermedios (77,1 y 82,4%). Aunque el tratamiento sto fue el más efectivo para desligar las sab de ambos sustratos, el tratamiento met produjo los pellets con la mayor similitud a las comunidades bacterianas ligadas a la digesta, y por lo tanto puede ser considerado como el dp más apropiado para tratar la digesta en fermentadores rusitec. en las pruebas 5 y 6 se utilizaron 4 ovejas canuladas en el rumen y el duodeno y 8 fermentadores rusitec, con el fin de determinar los efectos de la relación f:c y del tipo de forraje de la dieta sobre la fermentación ruminal, las comunidades microbianas y la diversidad bacteriana. El propósito del estudio fue determinar con qué exactitud pueden reproducir los fermentadores las diferencias entre dietas encontradas in vivo. Las cuatro dietas experimentales fueron las mismas que las utilizadas en la prueba 2. Los fermentadores rusitec detectaron diferencias entre dietas similares a las observadas en las ovejas al cambiar la relación f:c en el ph, la digestibilidad de la fibra neutro detergente, las concentraciones totales de vfa, las proporciones molares de acético, propiónico, butírico, isovalérico y caproico y la actividad amilasa. Por el contrario, los fermentadores rusitec no reprodujeron las diferencias encontradas en las ovejas para las concentraciones de n amoniacal y de láctico, la digestibilidad de la material seca, las proporciones de isobutírico y valérico, las actividades carboximetilcelulasa y xilanasa, y el crecimiento microbiano y su eficiencia. En lo referente al tipo de forraje de la dieta, los fermentadores detectaron diferencias similares a las observadas en las ovejas para la mayor parte de los parámetros, con la excepción del ph, la digestibilidad de la materia seca, la proporción de butírico y la actividad carboximetilcelulasa. Los valores mínimos de ph y máximos de concentración de vfa se alcanzaron a las 2 y a las 6-8 h tras la administración del alimento en las ovejas y en los fermentadores, respectivamente, indicando que la fermentación del alimento fue más lenta in vitro que in vivo. Hubo diferencias entre sistemas en la magnitud de la mayor parte de los parámetros determinados. En general, los fermentadores mostraron menores concentraciones de láctico, digestibilidad de la fibra neutro-detergente, relación acético:propiónico y actividades enzimáticas, y mayores valores de concentración de nh3-n, digestibilidad de la materia seca y proporciones de propiónico, butírico, isovalérico, valérico y caproico. el número total de bacterias fue mayor en el rumen de las ovejas alimentadas con dietas hf comparadas con las que recibían dietas hc, mientras que en los fermentadores ocurrió lo contrario. La relación f:c no afectó al número de bacterias celulolíticas en ninguno de los dos sistemas, pero este valor fue 2,7 y 1,8 veces mayor en las ovejas que en los fermentadores para las dietas hf y hc, respectivamente. El tipo de forraje no afectó a los números de bacterias totales ni celulolíticas en ningún sistema. el descenso en la relación f:c hizo aumentar el número de protozoos un 30% en las ovejas, pero no tuvo efecto en los fermentadores. Los números de isotrichidae y ophryoscolecinae en las ovejas no se vieron afectados por los cambios en la relación f:c, pero ambos grupos desaparecieron de los fermentadores que recibían las dietas hc. las concentraciones protozoos totales y de entodiniinae fueron mayores en las ovejas alimentadas con dietas que contenían heno de alfalfa en comparación con aquellas que consumían dietas con heno de gramíneas, mientras que en los fermentadores ocurrió lo contrario. Los resultados indican que, bajo las condiciones del estudio, las comunidades protozoarias en los fermentadores rusitec no fueron representativas de las del rumen de las ovejas que recibían las mismas dietas. Además, el número de protozoos fue 121 y 226 veces menos que en el rumen en los fermentadores hf y hc, respectivamente. para analizar la diversidad de las bacterias asociadas a la fase líquida (lab) y las sab en ambos sistemas se utilizó el análisis automatizado del espacio intergénico ribosomal (arisa) del rdna 16s. El número de picos de los pellets bacterianos aislados del rumen de las ovejas detectados en los electroferogramas del arisa osciló entre 24 y 52 para las lab y entre 23 y 77 para las sab, mientras que en los fermentadores rusitec esta cifra osciló entre 23 y 84 para las lab y entre 18 y 77 para las sab. No hubo diferencias entre las lab y las sab aisladas del rumen de las ovejas ni en el número de picos ni en el índice de shannon, pero en los fermentadores las lab mostraron mayor número de picos e índice de shannon, indicando una mayor diversidad en comparación con las sab. En el análisis de los dendogramas de las muestras in vivo se observó que los pellet sab aislados de las ovejas alimentadas con heno de alfalfa se agruparon juntos, mientras que la mayor parte de las sab aisladas de las ovejas que consumían heno de gramíneas se agruparon aparte, aunque aparentemente no hubo un efecto de la relación f:c. En los pellet lab in vivo no pudo establecerse un patrón de agrupamiento claro basado en el tipo de forraje ni en la relación f:c. En los fermentadores rusitec, los pellet sab formaron dos grupos principales de acuerdo al forraje, con dos subgrupos según la relación f:c. Por el contrario, los pellet lab se agruparon en primer lugar de acuerdo a la relación f:c, y dentro de cada grupo de acuerdo al tipo de forraje. Los resultados sugieren que en ambos sistemas las comunidades de sab estuvieron afectadas por el tipo de forraje, principalmente. cuando se analizaron los pellet en conjunto, el análisis de componentes principales discriminó claramente entre las muestras de ovejas y fermentadores, observándose dos grupos distintos para las muestras in vio e in vitro. Las diferencias observadas en la fermentación y las comunidades microbianas en las ovejas y los fermentadores pueden ser atribuidas principalmente a la ausencia de absorción en los fermentadores, a diferencias en el tiempo de retención del sólido y a la mayor compartimentalización del sistema rusitec. En general, los fermentadores rusitec simularon mejor la fermentación in vivo de las dietas con elevado contenido en forraje que la de las dietas que tenían un alto contenido en concentrado. en la última prueba (prueba 7), se administraron las 4 dietas utilizadas anteriormente a 6 ovejas fistuladas en el rumen en un diseño en cuadrado latino 4 x 4 parcialmente replicado para estudiar los efectos de la relación f:c y del tipo de forraje de la dieta en la producción de metano y en la fermentación microbiana de las mismas 4 dietas in vitro. En cada periodo se utilizó fluido ruminal de cada una de las ovejas para inocular bcrm que contenían 400 mg de la dieta correspondiente. Los bcrm se incubaron a 39ºc durante 24 h, y posteriormente se determinaron los principales parámetros de fermentación. No hubo interacciones f:c x el tipo de forraje en ninguna de las variables medidas. La relación f:c no afectó a la producción de metano tras 8 h, pero a las 24 h de incubación la cantidad de metano fue 1,2 veces mayor con el inóculo hc que con el hf. La produción total de vfa fue un 10,4 y un 10,0% mayor para el inóculo hc comparado con el hf cuando se incubaron los sustratos hf y hc, respectivamente. El cambio de la proporción f:c en la dieta no afectó a la producción de propiónico para ningún sustrato, pero la producción de butítico aumentó al hacerlo la proporción f:c en la dieta. La relación metano:vfa y la digestibilidad aparente de la materia seca no se vieron afectadas por la relación f:c en la dieta. Para todos los sustratos, las dietas con heno de alfalfa promovieron una mayor producción de gas y de metano tras 8 y 24 h, mayor producción de vfa totales e individuales, así como mayores relaciones acético:propiónico, concentraciones de n amoniacal y digestibilidad aparente de la materia seca en comparación con las dietas que contenían heno de gramíneas. El tipo de forraje en la dieta de los animales donantes no afectó a la relación metano:vfa cuando se incubaron los sustratos hf. Hubo claras variaciones entre ovejas en la producción de metano, que se mantuvieron independientemente de la dieta y el sustrato considerado. Los resultados indicaron que la producción de metano in vitro se ve afectada por la relación f:c y por el tipo de la dieta de los animales donantes de fluido ruminal, y por tanto estas variables deberían tenerse en cuenta cuando se realicen experimentos in vitro.
Datos académicos de la tesis doctoral «Estudios de simulación del ecosistema ruminal en sistemas in vitro: aspectos metodológicos«
- Título de la tesis: Estudios de simulación del ecosistema ruminal en sistemas in vitro: aspectos metodológicos
- Autor: María Eugenia Martínez Peláez
- Universidad: León
- Fecha de lectura de la tesis: 17/12/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- María José Ranilla García
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Jesús s. González álvarez
- sergio Calsamiglia blancaforf (vocal)
- eduarda Molina alcaide (vocal)
- (vocal)