Tesis doctoral de Felicitat Todolí Simó
La leishmaniosis es una enfermedad parasitaria causada por protozoos del género leishmania y transmitida por la picadura de insectos dípteros. Es endémica en 88 países, 72 de los cuales se encuentran en vías de desarrollo. Se calcula que más de 12 millones de personas la sufren y que cada año se producen 2 millones de nuevos casos, de los cuales 500 000 son debidos a leishmaniosis visceral (vl), la forma más grave y a menudo mortal de la enfermedad. En la forma zoonótica de la leishmaniosis visceral (zvl) causada por l. Infantum, el principal reservorio peridoméstico del parásito es el perro. El control de la zvl se basa actualmente en el diagnóstico y el tratamiento o sacrificio de los perros infectados, así como en la prevención de la infección mediante el uso de insecticidas. Para mejorar el diagnóstico de estos animales, sería de interés el hallazgo de proteínas inmunógenas del parásito que pudieran sustituir al antígeno crudo total de leishmania (ctla) y la leishmanina empleados actualmente, lo cual permitiría la estandarización, reproducibilidad y comercialización de nuevas pruebas de diagnóstico inmunológico más exactas. Sin embargo, la mejor estrategia de control de esta enfermedad según indican los modelos matemáticos, sería el desarrollo de una vacuna eficaz. Por el momento, dos vacunas contra la leishmaniosis canina (canl) han sido registradas y comercializadas en brasil, pero ninguna en europa. Diversas estrategias de vacunación han sido ensayadas contra leishmania sp. Y, de todas ellas, la prime-boost es la que parece más prometedora. De este modo, la vacunación conjunta con dna y proteínas recombinantes podría constituir una herramienta eficaz para el control de la zvl. el objetivo general de esta tesis ha sido evaluar la utilidad de cuatro antígenos recombinantes de l. Infantum (rkmpii, rtryp, rlack y rpaple22) en el control de la zvl mediante su utilización en técnicas de diagnóstico inmunológico humoral (estudio 1) y celular (estudio 2) en perros, y en diferentes estrategias de vacunación en hámsters (estudio 3). Para ello, empleamos extractos crudos de larvas de trichoplusia ni infectadas con baculovirus conteniendo las proteínas recombinantes rkmpii, rtryp, rlack y rpaple22 sin purificar. Las larvas de insectos lepidópteros infectadas con baculovirus son uno de los sistemas más potentes y versátiles para la producción de proteínas recombinantes, ya que permiten la obtención de grandes cantidades de proteína con la mayoría de modificaciones postraduccionales de los eucariotas y a bajo coste. la respuesta humoral y celular contra estas proteínas fue evaluada mediante elisa y mediante prueba de hipersensibilidad retardada (dth) en perros con leishmaniosis patente y en perros infectados sanos. La sensibilidad y especificidad de las técnicas basadas en los antígenos recombinantes se compararon con el elisa basado en ctla y con la prueba de dth empleando leishmanina (lst), respectivamente. La utilidad de estos antígenos en la vacunación fue evaluada en tres estrategias diferentes en el modelo de leishmaniosis de vl de hámster: proteína, dna y prime-boost heterólogo con dna-proteína. La inmunogenicidad de las vacunas fue valorada mediante la medición de los niveles de anticuerpos vacunales, la producción de óxido nítrico (no) y la capacidad parasiticida de los macrófagos infectados in vitro. La eficacia de las vacunas se evaluó mediante la determinación de la carga parasitaria en sangre y bazo, los niveles de anticuerpos contra el parásito y la histopatología a las 20 semanas tras la infección con l. Infantum. el análisis de la respuesta humoral específica en el estudio 1 mostró que el 75 % de los perros enfermos con serología positiva frente al antígeno crudo presentaba anticuerpos contra rkmpii, el 50 % contra rtryp y el 42 % contra rlack. Estos resultados demuestran que los tres antígenos, pero especialmente kmpii, son inmunógenos de las células b durante la canl. En 2 de los 5 perros con canl del estudio 2 se detectaron anticuerpos contra rpaple22, demostrando que este antígeno es también un inmunógeno de linfocitos b. No obstante, la estimación de la seropreValencia contra este último antígeno requeriría estudios con un mayor número de animales. La combinación de los elisa de rkmpii, rtryp y rlack en paralelo para el diagnóstico de la canl tuvo una sensibilidad del 93 % y una especificidad del 97 % no diferentes de las obtenidas con ctla-elisa, demostrando así que los tres antígenos producidos en larvas de t. Ni pueden ser utilizados para obtener una técnica sensible, específica, reproducible y de bajo coste para el diagnóstico de los perros con canl. Sin embargo, los perros infectados sin signos clínicos incluidos en el estudio 2 no presentaron anticuerpos frente a ctla y por tanto, tampoco frente a las proteínas recombinantes. la evaluación de la respuesta celular in vivo mediante dth en una población de perros residentes en zona endémica (estudio 2) mostró que el 27 % de los perros infectados presentaba una reacción dth positiva contra el antígeno rkmpii, el 50 % contra rtryp, el 18 % contra rlack y el 18 % contra rpaple22. Estos resultados demuestran que los cuatro antígenos, pero especialmente tryp, son capaces de estimular la respuesta de las células t durante la infección por l. Infantum. La combinación de los resultados de las pruebas de dth empleando rtryp y rkmpii en paralelo consiguió un 78 % tanto de sensibilidad como de especificidad, no diferente de la obtenida con lst, sugiriendo que ambos antígenos pueden ser componentes de una técnica de dth para el diagnóstico de los perros infectados. La evaluación de la respuesta celular mediante lst o la combinación de los resultados de dth de kmpii y rtryp en paralelo constituyeron las técnicas más sensibles para el diagnóstico de los perros infectados sin signos clínicos, superiores a la pcr cuantitativa en sangre. El papel que tryp parece desarrollar sobre la respuesta inmunitaria de los perros con infección subclínica, sugiere que este antígeno puede ser un prometedor candidato vacunal contra la canl. El escaso papel de rkmpii, rlack o rpaple22 en la respuesta celular en los perros con infección subclínica, en contraste con su elevado a moderado papel en la respuesta humoral durante la canl sugiere que estos antígenos deben ser empleados en estrategias de vacunación capaces de inducir una respuesta th1. de las tres estrategias de vacunación ensayadas en el modelo de leishmaniosis de hámster con estos cuatro antígenos, la prime-boost heteróloga con dna-proteína fue la que la que obtuvo un mayor grado de protección frente a la infección experimental con l. Infantum. Esta estrategia indujo un aumento significativo en la producción de no en los macrófagos infectados in vitro, así como una disminución significativa de la carga parasitaria en bazo (86 %) y sangre (99 %), y una disminución de los niveles de anticuerpos contra el parásito post-infección. Asimismo, la vacunación dna-proteína redujo significativamente la aparición de ciertas alteraciones histopatológicas en bazo e hígado relacionadas con la enfermedad en relación con el grupo control. Por su parte, la vacunación con dna desnudo no estimuló la producción de no, pero consiguió una disminución significativa del 90 % de la carga parasitaria en bazo, aunque no en sangre. Tras la vacunación con proteínas no se detectó inmunogenicidad ni protección. Los resultados demuestran que la estrategia prime-boost es capaz de estimular una potente respuesta celular, superior a la obtenida con proteínas recombinantes o con dna desnudo utilizando los mismos antígenos, la cual es además capaz de inducir un elevado grado de protección contra l. Infantum.
Datos académicos de la tesis doctoral ««vacunación y diagnóstico de la leishmaniosis visceral mediante proteínas recombinantes de leishmania infantum producidas en larvas de insecto»«
- Título de la tesis: «vacunación y diagnóstico de la leishmaniosis visceral mediante proteínas recombinantes de leishmania infantum producidas en larvas de insecto»
- Autor: Felicitat Todolí Simó
- Universidad: Autónoma de barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 29/10/2009
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Jordi Alberola Domingo
- Tribunal
- Presidente del tribunal: montserrat Gállego culleré
- Francisco Javier Nieto martínez (vocal)
- (vocal)
- (vocal)