Tesis doctoral de Sonia Martínez Páramo
Durante las últimas décadas, las consecuencias de las catástrofes naturales unidas a los efectos negativos de la actividad humana se han visto reflejadas en el deterioro de los hábitats naturales así como en la reducción de la variabilidad de las especies que habitan en ellos. Los cursos fluviales son uno de los hábitats más susceptibles, debido principalmente a que desde los comienzos de la civilización, los ríos han sido el foco de asentamiento de las poblaciones humanas. En la provincia de león, la degradación del medio fluvial, la pesca exhaustiva y los brotes epidémicos han diezmado algunas poblaciones de peces, siendo la especie más emblemática y más amenazada la trucha común (salmo trutta l.). Por ello, se han desarrollado durante años programas de cría en cautividad y repoblación, que han permitido contrarrestar en gran medida estos efectos. Sin embargo, la cría intensiva de trucha común presenta más dificultades que el cultivo de otras especies, debido en parte a que es muy susceptible de padecer enfermedades. La creación de stocks híbridos a partir de machos autóctonos y hembras de procedencia centroeuropea mejoró la productividad en cautividad. Sin embargo, este tipo de cruzamientos provoca introgresión génica de las poblaciones foráneas en el genoma de las poblaciones nativas, provocando la desaparición de caracteres seleccionados, favorables en un determinado hábitat y reduciendo la variabilidad génica de las poblaciones salvajes. La repoblación con stocks obtenidos a partir de las poblaciones nativas, requeriría crear un stock para cada población genéticamente diferenciada, lo que conlleva un gran coste y un riesgo de deriva génica a lo largo de las generaciones. En la cuenca del duero, que es la que nos ocupa, existen diferentes poblaciones que muestran características diferenciales y que se encuentran perfectamente caracterizadas. En este contexto, la creación de un banco de germoplasma, donde almacenar gametos y embriones, sería enormemente útil en programas de conservación, ya que permitiría la preservación del material genético que define una población, su posterior empleo para la fecundación y finalmente la reintroducción de las distintas variedades en sus lugares de origen. la criopreservación es el procedimiento más utilizado para preservar los gametos y embriones que constituyen un banco de recursos genéticos (grb), y la puesta a punto de un grb para cualquier especie requiere el dominio de esta técnica. Por ello nos proponemos comprobar si la criopreservación seminal garantiza la preservación de la variabilidad genética de las poblaciones de trucha amenazadas y analizar si el uso de proteínas anticongelación mejora los resultados obtenidos en la congelación de embriones de peces. aunque la criopreservación de semen de peces se ha llevado a cabo en más de 200 especies, la mayor parte de ellas de agua dulce, los estudios realizados en trucha común son muy escasos. Por otra parte, datos recientes sugieren que la congelación del semen promueve fragmentación de la cromatina e indican que podría afectar al perfil genético de la descendencia. El protocolo utilizado en este trabajo, resultó de adaptar uno descrito por nuestro equipo para trucha arco iris, donde se utiliza una solución crioprotectora que contiene yema de huevo como estabilizador de membrana y dmso como crioprotector principal. Para evaluar la calidad de la muestra antes y después de la criopreservación se realizaron estudios a nivel de estabilidad de la membrana plasmática, integridad del adn y capacidad fecundante de los espermatozoides. Ni el porcentaje de células viables (entendiendo como viables aquellas células que mantuvieron la membrana plasmática intacta), ni el valor medio de fragmentación del adn sufrió alteraciones significativas tras la criopreservación, aunque sí se redujo el porcentaje de células con menos del 5% de la cromatina fragmentada. Sin embargo, el porcentaje de huevos fecundados disminuyó de forma notable, debido probablemente a la suma de pequeños daños causados en las células a diferentes niveles durante el proceso. Aunque los daños a nivel del adn no fueron significativos tras la descongelación, se produjo una disminución en el número de espermatozoides que conservaban su genoma en estado intacto, por lo que no asegura que no haya consecuencias en la descendencia. Además, la selección de los espermatozoides más resistentes durante el proceso de criopreservación, también podría conducir a una selección de determinados caracteres, provocando una variación en el patrón genético de la siguiente generación. Por ello, se realizó el análisis de 9 microsatélites en la descendencia, que demostró que los patrones genéticos de las progenies obtenidas a partir de semen fresco y congelado eran idénticos. Este hecho implica que la criopreservación de semen de trucha común es una herramienta válida para preservar su potencial genético, y así poder utilizar estas muestras en posteriores programas de repoblación. en cuanto a la criopreservación de embriones y ovocitos de teleósteos, hasta el momento nunca se ha alcanzado con éxito este objetivo debido a su gran tamaño y su particular estructura. Teniendo en cuenta este factor, así como el hecho de que los embriones de salmónidos tienen un tamaño particularmente grande y un desarrollo lento, y que existe un escasísimo conocimiento sobre sus características criobiológicas, parece más adecuado utilizar una especie modelo que ha sido bien estudiada, es fácil de mantener en laboratorio y presenta embriones con características, a priori, más favorables para la criopreservación. Por eso, en los estudios realizados en el presente trabajo se utilizó el pez cebra como modelo, con el fin de desarrollar mejoras en la congelación de embriones que puedan ser en un futuro aplicadas a la trucha común. los mayores éxitos alcanzados en criopreservación de embriones de teleósteos, se obtuvieron cuando embriones de la especie pleuronectes americanus mostraron indicios de desarrollo tras la descongelación. Este hecho fue atribuido a que estos peces del ártico expresan unas proteínas anticongelación (afps) que actúan como crioprotectores naturales. Por eso, se creyó oportuno incorporar estas afps a los protocolos convencionales de criopreservación, ya que la incorporación o expresión de estas proteínas podría incrementar la resistencia a la criopreservación en animales que no las producen naturalmente. En estudios previos, el empleo de la microinyección para introducir las afps en embriones de rodaballo y de dorada, demostró que el daño mecánico que se produce durante la manipulación resulta incompatible con la vitrificación. En el presente estudio se han incubado embriones de pez cebra en varios estadios embrionarios (2-8 células, 128 células y blástula avanzada) en un medio que contiene afps. El análisis de microscopía confocal demostró que existe una estrecha ventana temporal en el desarrollo embrionario (durante el estadio de 128 células), en la cual los blastómeros de la línea marginal, que darán lugar a la línea sincitial y a órganos derivados del aparato digestivo anterior (faringe, páncreas e hígado), captan esas proteínas del espacio perivitelino, manteniéndose localizadas en esos puntos, al menos hasta la eclosión. Este hecho resultó ser un gran avance teniendo en cuenta que la línea sincitial es considerada la barrera más impermeable de la estructura embrionaria y más susceptible de sufrir daños durante el proceso de vitrificación/descongelación. El efecto crioprotector de estas proteínas, quedó demostrado desde el momento en que los embriones de pez cebra incubados con afps, resistieron mucho mejor las bajas temperaturas que los embriones control, duplicando el porcentaje de eclosión tras 45 minutos a -10 ºc. Tras la vitrificación también se observó el efecto beneficioso de las afps, ya que disminuyó el porcentaje de embriones que colapsan durante la descongelación, debido probablemente a que la presencia de estas proteínas en la línea sincitial confiere mayor resistencia a esta envuelta, protegiendo el saco vitelino y el compartimento celular. Sin embargo, además de la morfología embrionaria se consideró necesario evaluar los daños producidos a nivel celular, ya que los embriones son incapaces de continuar el desarrollo. Con este fin, se desarrolló un protocolo de evaluación del compartimento celular para cada embrión independiente, con el fin de obtener datos del estado del compartimento embrionario propiamente dicho. Los resultados mostraron que, tras la criopreservación, sólo el 50% de las células se mantiene viable independientemente de la incubación con afps, considerándose que este porcentaje de células viables es incompatible con el desarrollo embrionario. Sin embargo, las células procedentes de embriones incubados con afps mostraron mejor funcionalidad celular, ya que son capaces de sobrevivir en cultivo durante más tiempo que las células de embriones control. Los avances producidos demuestran que las afps ejercen un efecto crioprotector, pero ha de conseguirse una distribución más amplia de las mismas a lo largo del embrión para obtener mejoras significativas en los resultados. Los progresos obtenidos hasta el momento no son suficientes como para emprender estudios específicos en trucha común. teniendo en cuenta las dificultades que plantea la criopreservación de embriones, se planteó la posibilidad que incorporar las afps a los protocolos tradicionales de congelación de blastómeros como posible solución a la preservación del material genético de ambos progenitores. Los resultados obtenidos en pez cebra, también mostraron una notable mejoría, ya que el porcentaje de blastómeros viables se duplica al añadir afps a la solución crioprotectora. Este hecho probablemente fue debido a que además de inhibir el crecimiento de los cristales de hielo durante la congelación/descongelación, las afps actúan como agentes estabilizadores de membrana reduciendo los daños producidos por las bajas temperaturas. atendiendo a que el propósito de la presente tesis doctoral es establecer unas bases para la creación de un banco de germoplasma para las poblaciones de trucha común de la provincia de león, de los resultados obtenidos se puede concluir que: el protocolo descrito para criopreservación de semen es un método apropiado para preservar el potencial genético de los machos de esta especie, y por lo tanto es apto para congelar muestras destinadas a formar parte de un grb. Las técnicas de androgénesis permitirían obtener una descendencia cuyo material genético fuese únicamente de origen paterno, evitando así la introgresión génica en aquellos casos en que no haya disponibilidad de ovocitos de hembras pertenecientes a la población que sea necesario repoblar. Incluso con tasas de fecundación bajas se obtendría un número de individuos en la primera generación suficiente para recuperar la población original, debido a la gran prolificidad de estas especies. por otra parte, y teniendo en cuenta que la criopreservación de embriones está aun lejos de ser alcanzada, la congelación de blastómeros parece una opción más realista para preservar el material genético de ambos progenitores. Los avances realizados en este trabajo mediante incorporación de afps al medio de congelación, podrían ser aplicados para la criopreservación de blastómeros de trucha común. Una vez estandarizado el protocolo, la recuperación de la población amenazada podría ser llevada a cabo mediante microinyección de blastómeros para creación de quimeras o transferencia nuclear a ovocitos enucleados. Sin embargo, para llevar a cabo con éxito este proceso aún es necesario un largo proceso de investigación.
Datos académicos de la tesis doctoral «Bases para la elaboración de bancos de germoplasma de peces: aplicación a la trucha leonesa«
- Título de la tesis: Bases para la elaboración de bancos de germoplasma de peces: aplicación a la trucha leonesa
- Autor: Sonia Martínez Páramo
- Universidad: León
- Fecha de lectura de la tesis: 05/12/2008
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Paz Herraez Ortega
- Tribunal
- Presidente del tribunal: Luis Anel rodríguez
- elsa Cabrita (vocal)
- olvido Chereguini fernández-maquieira (vocal)
- José benito Peleteiro alonso (vocal)