Tesis doctoral de Koldobika Morante Sagasti
En el líquido exudado de la anémona de mar actinia fragacea se encuentra una ampliavariedad de proteínas tóxicas, entre las que se encuentran las actinoporinas, proteínascitolíticas que se caracterizan por tener una masa molecular de aproximadamente 20kda, carecer de cisteínas en su estructura primaria y tener un pi básico. Su efecto líticoconsiste en la formación de un poro transmembranal en las células diana que rompe labarrera de permeabilidad y da lugar a la muerte celular por choque osmótico. Otracaracterística distintiva de las actinoporinas es que su actividad citolítica resultainhibida por la esfingomielina.Actinia fragacea produce al menos cinco actinoporinas denominadas fragaceatoxina a(fraa), fragaceatoxina b (frab), fragaceatoxina c (frac), fragaceatoxina d (frad) yfragaceatoxina e (frae). Todas ellas son muy similares entre sí: sus masas molecularesrondan los 19,7 kda, presentan actividad hemolítica, sus pi son básicos y su estructurasecundaria es fundamentalmente de tipo b, otra característica distintiva de lasactinoporinas. Estas isoformas no son variantes alélicas sino que están codificadas portoda una familia de genes carentes de intrones y son, por tanto, proteínas parálogas quehan emergido a lo largo de la evolución mediante un mecanismo basado en unaduplicación de genes seguida de una evolución divergente. Este mecanismo es muy útilpara aumentar la capacidad depredadora de las anémonas, ya que consigue que susefectos se extiendan a una mayor diversidad de presas. El alineamiento de susestructuras primarias con el de otras actinoporinas y el posterior análisis filogenéticoconfirma su pertenencia a esta familia de proteínas.Aún poseyendo un elevado grado de identidad en sus secuencias, las pequeñasdiferencias que hay entre ellas se traducen en diferencias funcionales más o menosimportantes, tal y como se deduce a partir de los ensayos de hemólisis. Así, hemospodido distinguir dos grupos de fragaceatoxinas: las que presentan una elevadavelocidad hemolítica (frad y frae) y las que actúan de manera más lenta (fraa, frab yfrac). Esta diferenciación también se ha observado en los resultados obtenidosmediante la técnica de dicroísmo circular en los que se medía la variación en laelipticidad molar de la proteína a 210 nm en función de la temperatura: las toxinas conmayor actividad hemolítica (frad y frae) presentan una termoestabilidad menor (esdecir, se desnaturalizan a temperaturas más bajas) que las toxinas con menor actividadhemolítica (fraa y frab), que son más termoestables (se desnaturalizan a temperaturasmás altas).Capítulo 6 resumen y conclusiones190estas diferencias funcionales y estructurales (suponiendo que la distintatermoestabilidad se deba a ligeras diferencias estructurales) puede explicar, a grandesrasgos, el comportamiento de cada isoforma durante su elución a lo largo de unacolumna cromatográfica de interacción catiónica mediante un gradiente deconcentraicón de sal: fraa y la frab son las primeras en eluir mientras que frad y fraeeluyen en último lugar. El hecho de que frac aparezca en un volumen de eluciónintermedio entre los dos grupos permite predecir que comparte características de ambosgrupos: por un lado, su actividad hemolítica es baja (como la fraa y la frab) mientrasque, por otro lado, su estabilidad térmica se asemeja más a las de frad y frae.Evidentemente, las diferencias en el comportamiento de las distintas isoformas se debena pequeñas diferencias estructurales ocasionadas por las variaciones en su secuencia deaminoácidos. Con objeto de poder estudiar la importancia de ciertos aminoácidos sobrela actividad de la proteína se obtuvo la forma recombinante de la frac. La proteínaheteróloga y la nativa son prácticamente idénticas desde el punto de vista estructural yfuncional, tal y como se deduce a partir de los resultados obtenidos en los ensayos conmembranas naturales y membranas modelo y en los ensayos de estabilidad térmica. Laclonación de frac nos permite diseñar mutantes puntuales que nos permitan identificarlos aminoácidos especialmente importantes para el mantenimiento de la estructura y/ofunción.La determinación de la estructura terciaria de una proteína es de vital importancia paracomprender su mecanismo funcional. Combinando los estudios realizados hasta la fechacon los resultados de nuestros estudios estructurales, tanto de difracción de rayos-xcomo de criomicroscopía electrónica, se puede afirmar que este proceso consta de tresetapas: (1) unión de la proteína en forma monomérica a la membrana de la célula ovesícula, (2) oligomerización de los monómeros unidos para formar un preporo y (3)inserción del complejo proteico en la membrana.La resolución a 1,7 í¥ de la estructura monomérica de la frac permite identificaragrupaciones de aminoácidos implicadas en algunas de estas actividades. Así, en la zonabasal de la proteína se agrupan los residuos que participan en el reconocimiento de loslípidos y en la unión a la membrana diana (ser54, val87, ser105, pro107, tyr108,tyr110, trp112, tyr113, tyr133, tyr137, tyr138). También se pueden identificar losresiduos involucrados en la formación de enlaces hidrofóbicos que sujetan la a-hélicen-terminal (que es la que, en última instancia, dará lugar a la formación del poro) alcuerpo de la proteína. La estructura terciaria de frac es prácticamente idéntica a la deotras actinoporinas como la equinatoxina ii (1iaz) y la esticolisina ii (1gwy), tal ycomo se deduce a partir de los valores de rmsd de los carbonos a, que son 0,4 y 0,5,respectivamente.La obtención de la estructura cuaternaria de frac a una resolución de 1,8 í¥ muestra unnonámero con forma de corona. Esta corona tiene un diámetro externo de 11,2 nm, undiámetro interno de 5,2 nm y una altura de 4,3 nm. Esta estructura permite detallar lasinteracciones existentes en la interfase proteína-proteína que consiguen mantener lacapítulo 6 resumen y conclusiones191estructura anular del oligómero. La interacción principal se da entre la val60 de unprotómero y una cavidad del protómero contiguo en la que destaca la agrupación de losaminoácidos aromáticos phe16, trp149 y phe163. La val60 de un protómero penetraen el interior del bolsillo aromático a modo de conexión «caja y espiga». Si se comparanlas estructuras tridimensionales del monómero de frac y del protómero ensamblado seobserva que esta interacción es posible gracias a un ligero cambio conformacional queafecta a la orientación de la cadena lateral de la phe16 y que, de este modo, permite elacceso de la val60 a la cavidad hidrofóbica del protómero adyacente. Este cambio estáacompañado del desplazamiento de otros dos aminoácidos de la a-hélice n-terminal(asp17 y lys20), lo que, a la postre, reduce el área de contacto entre la región nterminaly el b-sandwich de la proteína en unos 45 í¥2. Esta reducción favorecería laseparación de la a-hélice n-terminal del sandwich-b y su inserción en la bicapa lipídica.A su vez, la phe16 está situada en el extremo amino de la a-hélice n-terminal y muycerca de la hélice 310. El cambio de orientación de la cadena lateral de este aminoácidopodría resultar clave para la formación de un segmento a-helicoidal de longitudsuficiente como para atravesar una membrana biológica ya que permitiría la elongaciónde la a-hélice n-terminal por su extremo amino y su fusión con la hélice 310 adyacente,dando lugar a una única a-hélice lo suficientemente larga como para atravesar la bicapa.Este mecanismo de inserción guardaría cierta similitud con el mecanismo descrito parala toxina citolisina a (clya) que se encuentra en algunas cepas de escherichia coli y desalmonella enterica.La comparación de las estructuras tridimensionales del monómero de frac y delprotómero ensamblado revela una segunda zona que también sufre cambiosconformacionales: se trata del lazo que contiene los aminoácidos trp112 y tyr113. Elmovimiento de las cadenas laterales de estos dos aminoácidos tiene lugar en respuesta ala presencia de una molécula de detergente ldao que se encuentra en la estructuracristalina del oligómero. En condiciones biológicas, este cambio estaría ocasionado porla interacción con determinados lípidos de la membrana.Para comprobar si la estructura cristalográfica del oligómero se corresponde con la quese produce en condiciones fisiológicas se hicieron reconstrucciones tridimensionales defrac insertada en vesículas de sm:dopc (1:1) a partir de imágenes bidimensionalesobtenidas mediante criomicroscopía electrónica. Los resultados obtenidos arrojaronunas dimensiones muy parecidas a las de la estructura oligomérica cristalizada. Cuandose procesaron las imágenes imponiendo una simetría de orden nueve se consiguióaumentar la resolución y obtener las dimensiones del poro funcional, que resultó tenerun diámetro de 1,5 nm, algo menor de lo que se puede encontrar en la bibliografía de lasactinoporinas (en torno a 2 nm de diámetro). También se consideró la posibilidad de queel poro estuviese formado por ocho o por diez monómeros, pero en ambos casos elajuste de éstos al mapa de densidad electrónica no mejoraba el del nonámero.Partiendo de estos resultados se construyó, a partir de la estructura cristalográfica delprotómero, un modelo de poro en el que las a-hélices n-terminales estuvieseninsertadas. El proceso consistió básicamente en alargar la ¿-hélice n-terminal yextenderla hasta formar un ángulo de aproximadamente 30º con el plano normal a labicapa. Posteriormente, se aplicó una simetría de orden nueve a este protómeromodificado para generar un modelo del oligómero insertado. La estructura resultante esun haz de a-hélices muy parecido al que se observa en la estructura tridimensional de laproteína wza, un translocón de los polisacáridos que forman parte de la cápsulabacteriana de e. Coli.Las imágenes obtenidas por microscopía de fuerza atómica de los poros formados porfrac en bicapas planas también ofrecen la misma disposición hexagonal observadatanto en la estructura cristalográfica como en las micrografías obtenidas porcriomiscroscopía electrónica (crio-tem). Además, las dimensiones del poro son muyparecidas, lo que nos lleva a la conclusión de que el poro que forman las actinoporinasestá formado por nueve monómeros de proteína que atraviesan la membrana formandoun barril a-helicoidal del que no forman parte los lípidos de la membrana. Estosresultados obligan a replantear el modelo de poro toroidal que, a día de hoy, es el másaceptado por la comunidad científicapara una mayor precisión en la determinación del tamaño del poro funcional se procedióa incubar la proteína con vesículas unilamelares gigantes de sm:dopc (1:1) enpresencia de solutos fluorescentes de distintos tamaños. El tamaño del porodiscriminaría la entrada de solutos al interior de la vesícula en función de sus radioshidrodinámicos y esto se podría visualizar mediante un microscopio confocal defluorescencia. Los solutos utilizados para el experimento fueron tres: alexa fluor 488(af488), af633 y af680. Los dos primeros, el af488 y el af633 fueron capaces deacceder al interior de los liposomas a través de los poros formados por frac. El af680,sin embargo, quedaba completamente excluido, probablemente por ser demasiadogrande. La determinación del tamaño de estos solutos fluorescentes se llevó a cabomediante espectroscopía de correlación de fluorescencia. El radio hidrodinámico delaf488 y del af633 resultaron ser de 0,54 nm y de 0,77 nm, respectivamente. Eltamaño del af680 fue imposible de medir debido a la falta de estabilidad de la señalfluorescente. Debido a que la masa molecular del af680 (~ 1150 da) es parecida a ladel af633 (~ 1200 da) y considerando que ambas moléculas son globulares, el tamañodebe de ser parecido. Es por tanto que se deduce a partir de esta técnica que el tamañodel poro funcional debía de ser no mucho mayor de 1.54 nm, un valor que se ajustabastante bien a las dimensiones obtenidas por microscopía electrónica.De la observación y comparación de la estructura terciaria de frac en estadomonomérico y cuando está formando parte del oligómero se pudieron identificar dosaminoácidos que podrían ser cruciales para el mecanismo de inserción: se trata de laval60 y de la phe16. Para poner de manifiesto su importancia para el mantenimiento dela estructura y/o función de frac se diseñaron diversos mutantes puntuales a partir de lafrac clonada. Los aminoácidos elegidos para sustituir a la val60 fueron la arginina (r)y la lisina (k), por tener carga positiva, el ácido glutámico (e), por tener carga negativay la fenilalanina (f), por ser aromático. Estas sustituciones puntuales dieron lugar a loscapítulo 6 resumen y conclusiones mutantes denominados v60r, v60k, v60e y v60f, respectivamente. Por otro lado, sedecidió sustituir la phe16 por la prolina (p). Como este aminoácido no puede formarparte de una a-hélice daría lugar a un mutante capaz de oligomerizar pero incapaz deinsertar su a-hélice n-terminal. El mutante correspondiente se denomina f16p. Porúltimo, se diseñó otro mutante en esta misma región n-terminal. El cambio introducidoconsiste en la adición de un segmento extra de 6 histidinas en el extremo amino defrac. Se trata de una modificación habitual de muchas proteínas recombinantes, ya quefacilita enormemente su purificación, que se reduce a una única cromatografía encolumna a través de una resina que contiene níquel.A partir de los resultados obtenidos en monocapas lipídicas, se deduce que lasmutaciones introducidas en la posición 60 no alteran su interacción inicial con lamembrana diana pero sí alguna de las etapas posteriores, ya que la inserción de losmutantes en monocapas da lugar a menores incrementos de la presión superficial en elequilibrio.Las mutaciones introducidas en la posición 60 reducen notablemente la actividadhemolítica de la proteína, particularmente en el caso de v60e. Sin embargo, losexperimentos de entrecruzamiento indican que estos cambios no impiden laoligomerización de frac, como se había supuesto. Como la superficie de contacto entrelos protómeros es tan amplia y la complementariedad entre estas superficies es tanelevada, la sustitución de un único aminoácido no basta para evitar la formación delnonámero. Por tanto, la reducción en la actividad permeabilizadora de frac se debe a laalteración de alguna etapa posterior a la oligomerización. La val60 está muyconservada entre las actinoporinas, y si no hay valina el aminoácido que la sustituye esla isoleucina, cuya cadena lateral es muy parecida (tiene un grupo metileno adicional).Es muy probable que al cambiar la valina por otros aminoácidos se esté interfiriendo enla interacción normal de este residuo con la agrupación de aminoácidos aromáticospresente en una cavidad perteneciente al protómero adyacente. Con ello se evitaría o sedificultaría la elongación de la a-hélice n-terminal de frac de modo que no puedaalcanzar la longitud suficiente como para atravesar una bicapa lipídica y dar lugar a unporo funcional. La presencia de una ácido glutámico en esta posición es la que másinterfiere con la actividad hemolítica y la que inhibe por completo la permeabilizaciónde vesículas unilamelares grandes.Las mutaciones que afectan a la región n-terminal de frac dan lugar a una drásticareducción de su actividad hemolítica, pero no llegan a anularla del todo. Losexperimentos realizados en monocapas lipídicas con el mutante f16p y con el mutantecon una cola de 6 histidinas indican que su inserción en la monocapa se ve reducida, yaque se observa una disminución de la pendiente de la línea de regresión de la gráfica dpvs. P0. Sin embargo, los incrementos que provocan en la presión superficial tras suincorporación a la interfase líquido-aire son mayores. Esta aparente contradicción puededeberse a que en este sistema modelo los mutantes adoptan una conformación en la quela región n-terminal no está insertada perpendicularmente a la monocapa sino que sedispone de forma paralela a ella. Esta conformación podría corresponder a la delintermediario m2 que se forma durante el proceso de inserción de las actinoporinas.
Datos académicos de la tesis doctoral «Purification and characterization of the structure and function of a novel actinoporin isolated from the sea anemone actinia fragacea«
- Título de la tesis: Purification and characterization of the structure and function of a novel actinoporin isolated from the sea anemone actinia fragacea
- Autor: Koldobika Morante Sagasti
- Universidad: País vasco/euskal herriko unibertsitatea
- Fecha de lectura de la tesis: 27/09/2012
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Juan Manuel González Mañas
- Tribunal
- Presidente del tribunal: felix María Goñi urcelay
- álvaro Martínez del pozo (vocal)
- Martinez caaveiro José Manuel (vocal)
- ariana Barlí¯c — (vocal)