Tesis doctoral de Ana Quiros Del Bosque
Leches fermentadas con actividad antihipertensiva: identificación de péptidos y evaluación de su biodisponibilidad resumen en la presente tesis doctoral se ha llevado a cabo la identificación de nuevos péptidos con actividad inhibitoria de la enzima convertidora de angiotensina (ieca), obtenidos por fermentación y/o hidrólisis enzimática. Asimismo, se han realizado estudios de biodisponibllldad de los péptidos de interés, mediante ensayos de simulación de la digestión gastrointestinal con enzimas digestivas, ensayos de absorción intestinal con cultivos celulares y evaluación de la resistencia de los péptidos a las peptidasas sanguíneas mediante la realización de ensayos con plasma. También se investigó sobre la producción de péptidos bioactivos durante la digestión gastrointestinal de leche humana y fórmulas infantiles mediante procesos de hidrólisis in vitro que simulan condiciones fisiológicas. Esta tesis se ha estructurado en tres partes. en el primer apartado, se ha evaluado la actividad ieca en un kéfir comercial de leche de cabra. Se han aislado e identificado los péptidos inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina incluidos en el extracto soluble en agua del kéfir. El aislamiento de los péptidos se ha realizado mediante dos etapas de cromatografía y posteriormente se han secuenciado por espectrometría de masas en tándem. Se ha realizado una simulación de la digestión gastrointestinal para evaluar la resistencia de los péptidos identificados a las enzimas digestivas o la formación de nuevos péptidos activos con actividad ieca. Los resultados mostraron que el kéfir presentaba una actividad ieca moderada. Se identificaron 16 péptidos, dos de los cuales con secuencias pyvryl y lvypftgpipn, mostraron una potente actividad ieca. Tras la simulación de la digestión de los péptidos identificados, la actividad ieca fue similar o ligeramente inferior que la de los péptidos sin hidrolizar. Sin embargo, se pudo observar un aumento importante de la actividad tras la hidrólisis del péptido dkihpf. en una segunda parte, se ha estudiado la actividad ieca de cuatro leches fermentadas con distintas cepas de enterococcus faecalis, y se han identificado los péptidos responsables de su actividad. Además, se ha desarrollado un método mediante cromatografía de líquidos acoplado a espectrometría de masas en tándem que permite la cuantificación de péptidos activos en leches fermentadas. Se han realizado estudios de biodisponibilidad, de tipo y cinética de inhibición de la eca, y de relación estructura/actividad de los péptidos de interés. También se ha obtenido el péptido antihipertensivo hlplp por hidrólisis enzimática. De este modo, se ha visto que las leches fermentadas con distintas cepas de e. Faecalis presentan una alta capacidad para inhibir la eca. Se han identificado 8 péptidos en una leche fermentada con e. Faecalis cect 5727, siendo de especial interés los fragmentos 58-76 y 133-138 de la b-caseína, con secuencias lvypfpgpipnslpqnipp y lhlplp, que presentaron una potente actividad ieca. Los resultados sobre la evaluación de la biodisponibilidad mostraron que, de las secuencias identificadas, el péptido lhlplp fue el único que resistió la hidrólisis con las enzimas gastrointestinales. Mediante los estudios con células caco-2 se pudo concluir que el lhlplp es hidrolizado por las peptidasas celulares dando lugar al péptido hlplp el cual se transporta a través de la monocapa de células caco-2, siendo la difusión pasiva por vía paracelular el principal mecanismo de transporte de este péptido. El hlplp es resistente a las peptidasas plasmáticas humanas durante 4 horas en las condiciones ensayadas, por lo que podría ser la forma activa del péptido lhlplp. Sin embargo, ni el lhlplp, ni ninguno de sus fragmentos, incluyendo el hlplp, se han podido encontrar en plasma de rata tras la administración del péptido. El péptido lhlplp se comporta como un verdadero inhibidor de la eca y presenta un tipo de inhibición competitiva. De los estudios de estructura/actividad se pudo concluir que las sustitución de leu en penúltima posición por gly, y la sustitución de pro en la posición carboxilo terminal por arg, en la secuencia lhlplp aumenta 2 y 5 veces la actividad ieca. en la tercera parte de esta tesis doctoral, se ha evaluado la actividad ieca y la actividad antioxidante en muestras de leche humana y en fórmulas infantiles tras una simulación de la digestión gastrointestinal. Tras la digestión, la fracción peptídica procedente de la leche humana mostró una moderada actividad ieca, comparada con las actividades encontradas en el permeado de las fórmulas infantiles. Se han identificado los péptidos producidos tras las simulación gastrointestinal de las muestras de leche humana, de especial interés fue el fragmento 125-129 de la b-caseína, hlplp, que presentó una potente actividad para inhibir a la eca. Esta secuencia se encuentra en una región de la b-caseína muy conservada entre las distintas especies de mamíferos, por lo que su liberación durante la digestión podría tener algún significado fisiológico. El fragmento b-caseína (154-160), wsvpqpk, hallado también en las leches humanas tras la simulación gastrointestinal, mostró una potente actividad antioxidante. Summary this thesis describes the identification of several novel peptides with angiotensin-converting-enzyme (ace)-inhibitory activity obtained by enzymatic hydrolysis and fermentation processes. In addition, bioavailability studies of the most potent ace-inhibitory peptides were performed through simulation of gastrointestinal digestion assays, intestinal absorption with cell cultures experiments and evaluation of the peptides resistance to the plasma peplidases. Moreover, the production of bioactive peptides during gastrointestinal digestion of human milk and infant formulas was resumen: investigated by in vitro hydrolysis processes simulating physiological conditions.This memory has been structured in three sections: in the first part, the angiotensin converting enzyme (ace)-inhibitory activity of a commercial kefir made from caprine milk was evaluated. Isolation and idenfication of active peptides were carried out in the 3000 da-water soluble extract from this fermented product. Isolation of the peptides was performed by following two chromatographic sleps, and the peptides were sequenced by tandem mass spectrometry. In orderto evaluate the resistance of these peptides to digestive enzymes and/orthe release of new active peptides, simulated gastrointestinal digestion of the identified peptides was also carried oul. The results showed that kefir possesed moderate ace-inhibitory activity. Sixteen peptides were identified, two of these peptides, with sequences pyvryl and lvypftgpipn, presented potent ace-inhibitory properties. After simuiated gastrointestinal digestion of these peptides, the ace-inhibitory activity was similar or slightly lower than that of the non-hydrolyzed peptides. However, a remarkable increase in the activity was observed upon hydrolysis of peptide dkihpf. in a second part, the ace-inhibitory activity of four fermented milks produced with different strains of enterococcus faecalis was studied. The peptides responsible of this activity were also identified. With the aim of quantifying the active peptides in the fermented milks, an hplc coupled to tandem-mass-spectrometry method was developed. The most active ace-inhibitory peptides were used to perform the bioavailability studies, ace-inhibition kinetics and structure-activity relationships. Besides, antihypertensive sequence hlplp was obtained by enzymatic hydrolysis. The results showed that milk fermented with different strains of e. Faecalis possesed high capacity to inhibit ace. Eight peptides were identified in milk fermented with e. Faecalis cect 5727. Of special interest were fragments 58-76 and 133-138 of b-casein, which exerted a potent ace-inhibitory activity. Bioavailability results showed that, of identified sequences, only the peptide lhlplp was resistant to digestive enzymes. From the studies with caco-2 cells, it was concluded that the peptide lhlplp is hydrolysed by brush border peptidases releasing the pentapeptide hlplp, which is transported through caco-2 monolayer by pasive difussion via paracellular route. The peptide hlplp was resistant to human blood peptidases for 4 hours, in the conditions assayed, and this sequence could be the active form of the peptide lhlplp in the organism. However, neilher lhlplp or any of their fragments includying the peptide hlplp were found in rat plasma after peptide administration. Peplide lhlplp is a true inhibitor of ace and shows a competitive inhibition type. The structure-activity studies demonstrated that the substitution of leu in the penultimate position by gly, and substitution of pro in the carboxi-terminal position by arg, yielded an increase, ranged between 2 and 5, in the ace-inhibitory activity of lhlplp in the third part of this thesis, the ace-inhibitory and the antioxidant activity of human milk samples and infant formulas subjected to simuiated gastrointestinal digestion were evaluated. The peptidic fraction from human milk after simuiated gastrointestinal digestion showed moderate ace-inhibitory activity compared to that found in the permeate of infant formulas. Of special interest was fragment 125-129 of beta-casein, hlplp, which was found in human milk samples subjected to simuiated gastrointestinal digestion. This peptide exhibited potent ace-inhibitory activity. This region of the beta-casein molecule is highly preserved between different mammalian species thus its releasing during digestion could have a physiological significance. The fragment 154-160 of beta-casein, wsvpqpk, which was also found in hydrolysed human milk samples showed potent antioxidant activity
Datos académicos de la tesis doctoral «Leches fermentadas con actividad antihipertensiva: identificación de péptidos y evaluación de su biodisponibilidad.«
- Título de la tesis: Leches fermentadas con actividad antihipertensiva: identificación de péptidos y evaluación de su biodisponibilidad.
- Autor: Ana Quiros Del Bosque
- Universidad: Autónoma de Madrid
- Fecha de lectura de la tesis: 09/03/2007
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- María Isidra Recio Sanchez
- Tribunal
- Presidente del tribunal: manuela Juarez iglesias
- federico Morais fernandez sanguino (vocal)
- rosina Lopez alonso fandiño (vocal)
- Francisco Millan rodriguez (vocal)