Tesis doctoral de Carmen Giovana Granados Ramírez
Diseño, síntesis y caracterización de inhibidores de la fusión de vih-1 análogos del péptido c34 de gp41 con d aminoácidos. en el proceso de fusión del virus del vih-1 a la célula diana intervienen las proteínas de la cubierta viral gp 120 y gp41. La gp120 al interaccionarcon el receptor cd4 y co-receptores sufre un cambio conformacional que enseguida causa cambios en la estructura de gp41. Esta proteína sufre una reorganización que conduce al acercamiento entre la región n-terminal y la región c-terminal de gp41 aproximando las membranas celular y viral entre sí. Péptidos derivados de estas regiones, en especial de la región c-termial, son inhibidores de la fusión del vih-1 a la célula blanco. Uno de estos péptidos denominado c34 tiene buenas propiedades como inhibidor de la fusión viral y forma complejos estables con el péptido n36 derivado de la región n-terminal de gp41. En este capítulo se describió el efecto de cambiar la quiralidad del péptido c34 total o parcialmente, para aumentar la estabilidad de este péptido frente a proteasas. Mientras los péptidos derivados de c34 con todo-d aminoácidos fueron incapaces de inhibir la fusión del vih-1; los péptidos heteroquirales, derivados de c34 con modificaciones puntuales por aminoácidos d en región c y n-terminal, son capaces de formar complejos estables con un péptido de la región n-terminal de g41 y pueden inhibir la fusión con un aumento de estabilidad frente a la degradación por parte de la tripsina. identificación de complejos heteroquirales entre péptidos todo-d y el fragmento n-terminal del dominio de b de la proteína a de staphyloccus aureus la proteína a es un factor patogénico encontrado en la superficie del staphylococcus aureus. Esta proteína se ha usado extensivamente en técnicas inmunológicas debido a su habilidad para unirse al fragmento cristalizable de las inmunoglobulinas g1,2. Los responsables de este reconocimiento son 5 dominios analógicos denominados a, b, c, d y e. El dominio más estudiado de esta proteína es el dominio b, este dominio de 61 residuos se pliega en un trímero de hélices antiparalelas. Péptidos derivados de la región n-terminal de este dominio no tienen una estructura estable en solución. Sin embargo, la presencia de la región de péptidos correspondientes a la región c-terminal del dominio forman complejos en solución que aumentan el contenido helicoidal del sistema. En este capítulo se diseñó una quimioteca oboc (del inglés «one bead one compound») de 4096 péptidos con aminoácidos d. Derivados de la secuencia de la hélice c-terminal el dominio b, con el objetivo de identificar péptidos todo-d capaces de interactuar con el fragmento n-terminal del dominio b. La quimioteca fue sintetizada sobre una resina de polietilenglicol (pega), compatible con medios acuosos, unida al espaciador bifuncional hmfs usando la estrategia de síntesis boc/bzl. 21 péptidos de la quimioteca se encontraron afines al fragmento n-terminal del dominio b. El análisis de los péptidos mostró el motivo d-trp-d-lys en todas las secuencias. En un grupo de seis péptidos, posteriormente resintetizados, se encontró que conservaban la tendencia conformacional a hélice alfa, de acuerdo a los espectros de dicroísmo circular. De acuerdo a lo encontrado por estudios realizados usando resonancia de plasmon superficial, los péptidos todo-d se unían con el fragmento n-terminal del dominio b formando complejos heteroquirales. síntesis, caracterización estructural y evaluación de la interacción con inmunoglobulina g de nuevos análogos del dominio b de la proteína a de staphylococcus aureus. los fragmentos correspondientes a la hélice c-terminal y región n-terminal del dominio b de la proteína a de s. Aureus forman complejos que aumentan la helicidad del sistema. En nuestro grupo se identificaron dos péptidos, que forman complejos con el fragmento n-terminal del dominio b, a partir del análisis de una quimioteca oboc de péptidos con solo aminoácidos l derivados de la hélice c-terminal del dominio b. Estos análogos se diferenciaban del péptido natural en los residuos ser 44 y leu 47. En este capítulo se describe la caracterización estructural y evaluación de la actividad de los complejos no covalentes formados entre estos péptidos y el fragmento n-terminal del dominio b. Después de comprobar que el fragmento n-terminal interaccionaba con los análogos no naturales de la hélice c-terminal se sintetizaron los dos dominios b análogos, de 61 residuos, con las modificaciones encontradas en la región c-terminal (ser44phe leu47lys y ser44phe leu47val). El análisis de estructura por dicroísmo circular reveló que los análogos mostraban estructura helicoidal e incluso uno de ellos era térmicamente más estable. Por resonancia de plasmon superficial se encontró que los análogos se unían a inmunoglobulina de conejo y al fragmento cristalizable de las inmunoglobulinas humano con una afinidad similar, aunque con cambios en las cinéticas de asociación y disociación. La información estructural de cada residuo se analizó por medio de resonancia magnética nuclear. El cálculo de la desviación de los desplazamientos químicos y análisis de noes manifestó que los dominios análogos conservaron tres regiones helicoidales. Los experimentos de intercambio h/d mostraron que el empaquetamiento de los análogos difería ligeramente del dominio b natural en las regiones que conectan las hélices. Este análisis permitió evaluar la capacidad de la estrategia combinatoria oboc para diseñar nuevas proteínas partiendo del reconocimiento entre fragmentos peptídicos. El diseño de este tipo quimiotecas permitirá introducir modificaciones no naturales en el diseño de nuevas proteínas aumentando la diversidad de estructuras disponibles.
Datos académicos de la tesis doctoral «Diseño, síntesis y estructura de dominios helicoidales. influencia de la introducción de aminoácidos d«
- Título de la tesis: Diseño, síntesis y estructura de dominios helicoidales. influencia de la introducción de aminoácidos d
- Autor: Carmen Giovana Granados Ramírez
- Universidad: Barcelona
- Fecha de lectura de la tesis: 16/01/2008
Dirección y tribunal
- Director de la tesis
- Ernest Giralt Lledo
- Tribunal
- Presidente del tribunal: david Andreu martínez
- miriam Royo expósito (vocal)
- Marta Vilaseca casas (vocal)
- (vocal)