Síntesis y evaluación biológica de nuevos sistemas bicíclicos [4.1.0] obtenidos mediante reacciones de ciclopropanación estereoselectivas

Tesis doctoral de Irene Suárez Del Villar Carrero

Síntesis de nuevos sistemas bicíclicos con potencial actividad mediante reacciones de ciclopropanación estereoselectivas. 1. Resumen. los anillos ciclopropánicos fusionados a otros ciclos se encuentran presentes en diversos productos naturales y moléculas sintéticas que presentan interesantes actividades biológicas. En la tesis doctoral que aquí se presenta pretendemos aprovechar la experiencia sintética descrita en la literatura para aplicarla a la obtención de compuestos que podrían tener diferentes aplicaciones terapéuticas. así, la reacción de ciclopropanación estereoselectiva será la base para la síntesis de nuevos sistemas bicíclicos [4.1.0] como potenciales inhibidores de la óxido nítrico sintasa (inos) a finales de los noventa se describió el derivado amidínico cíclico denominado ono-1714 como novedoso inhibidor selectivo de la isoforma inos humana que juega un papel importante en diversos trastornos tales como el choque séptico, la artritis reumatoide o la enfermedad inflamatoria intestinal. También se ha demostrado su implicación en enfermedades neurodegenerativas como el parkinson. al tratarse de un compuesto de reciente descubrimiento y poseer una estructura muy diferente a la de los otros inhibidores de inos conocidos, hasta ahora existen pocos derivados descritos. apenas se han efectuado estudios de relación estructura-actividad (rea) para este nuevo compuesto que permitan extraer información sobre los requerimientos estructurales para una adecuada actividad. Para conocer nuevos aspectos acerca de la actividad inhibitoria sobre estas enzimas se obtendrán nuevos compuestos amidínicos portando ciclopropanos don diferentes sustituyentes. para el presente proyecto se proponen dos varias estrategias sintéticas que comparten la reacción de ciclopropanación estereoselectiva como reacción clave común para la obtención de derivados de ono-1714. a) reacción de ciclopropanación por descomposición de diazocompuestos mediada por metales de transición. b) organocatálisis: reacción de ciclopropanación vía iluros de amonio ¿ organocatálisis: el interés actual de la organocatálisis se centra sobre todo en el uso de catalizadores quirales para dar nombre a lo que se conoce como organocatálisis asimétrica, ya que ésta permite llevar a cabo una transferencia de quiralidad con un coste mínimo en términos de economía atómica y en un único paso, de forma respetuosa con el medio ambiente, ya que se trata de compuestos orgánicos, libres de metales, ópticamente activos que se utilizan de forma catalítica. ¿ evaluación biológica la evaluación de todos estos compuestos se efectuará en primer lugar mediante ensayos enzimáticos sobre enzima inos recombinante de ratón. Y se determinará el porcentaje de producción de óxido nítrico en macrófagos peritoneales activados de ratón. a) reacción de ciclopropanación por descomposición de diazocompuestos mediada por metales de transición. a.1) introducción. a finales de los noventa se describió el derivado amidínico cíclico denominado ono-1714 como novedoso inhibidor selectivo de la inos inducible humana humana que juega un papel importante en diversos trastornos tales como el choque séptico, la artritis reumatoide o la enfermedad inflamatoria intestinal. También demostró su implicación en enfermedades neurodegenerativas como el parkinson y el cáncer.[1] al tratarse de un compuesto de reciente descubrimiento y poseer una estructura muy diferente a la de los otros inhibidores de oxido nitricosintasa conocidos, hasta ahora existen pocos derivados descritos. apenas se han efectuado estudios de relación estructura-actividad (rea) para este nuevo compuesto, siendo la posición 7 la menos explorada. Estudios de docking preliminares han determinado la presencia de un bolsillo pequeño de la enzima en el cual se introduce el átomo de cloro. Para conocer nuevos aspectos acerca de la actividad inhibitoria sobre la inos nos propusimos obtener nuevos sistemas bicíclicos [4.1.0] que portasen en su estructura de ciclopropano una cadena lateral polar, para determinar si este tipo de cadena lateral influye sobre la actividad biológica de la inos. extendiendo, así, estudios aparecidos en la literatura referentes a miméticos de arginina.[2] a.2) antecedentes. el óxido nítrico (no) es un gas simple que se libera por la conversión de l-arginina en l-citrulina. Es un mediador biológico que juega un papel muy importante en varios procesos patológicos. El no es producido por una familia de enzimas llamadas las óxido nítrico sintasas (nos). Una de ellas es la isoforma de la nos inducida por estímulos inmunológicos o inflamatorios se la conoce como inos, en muchos trabajos se la identifica con las abreviaturas (nos tipo ii, nos-2, macnos, hepnos). El desarrollo de inhibidores selectivos de las diferentes isoformas de la nos (hay otras dos: enos y nnos) podría suponer poder controlar determinados estados patológicos una sobreproducción de no por inos parece estar implicada en la destrucción tisular que ocurre en determinados estados tales como la inflamación crónica, hipotensión, disfunción vascular en diabetes, el shock séptico o desórdenes neurodegenerativos. [3] además muy recientemente ha aumentado el número de estudios que sugieren una implicación de no producido por inos en la carcinogénesis, invasión o daño al adn en múltiples tipos de cáncer. [4] se han diseñado numerosos inhibidores de inos, que suelen actuar compitiendo con la l-arginina por el sitio de unión. Unos son derivados estructurales sencillos como n-mono-metil-l-arginina (l-nmma) o la n-nitro-l-arginina (l-name), y otros son inhibidores con estructura de no aminoácidos derivados de isotiourea, amidina o mercaptoalquil-guanidinas pero que en su mayoría carecen de selectividad frente a las difentes isoformas de nos. El compuesto ono-1714, muestra una elevada selectividad por la isoforma inos humana y posee una estructura diferente a los otros inhibidores de nos. Se llegó a él por hibridación estructural de dos inhibidores conocidos, 1 y 2, sin estructura de aminoácidos. La máxima actividad biológica se logró al rigidificar el compuesto 3 mediante la incorporación de un anillo de ciclopropano con lo que se llegó a 4 a partir de cual se desarrolló ono-1714, compuesto que se encuentra actualmente en la fase ii de ensayos clínicos.[1](esquema 1). esquema 1 a.3) objetivos. existen pocos derivados de ono-1714 descritos en la bibliografía. [5,6] nuestro objetivo es buscar una nueva serie de derivados de ono-1714 con mayor selectividad y completar, además, los escasos estudios de relación estructura actividad (rea) hasta ahora existentes. Para lo cual se llevó a cabo la síntesis de los siguientes derivados. (Figura 1) figura 1 como paso clave de la síntesis, de los compuestos objeto de estudio se llevaron a cabo reacciones de ciclopropanación estereoselectivas, siguiendo una vía catálisis organometálica. En concreto, se llevó a cabo una reacción de ciclopropanación vía descomposición de diazocompuestos catalizada por metales de transición. (Esquema 2) esquema 2 los complejos de metales de transición son capaces de catalizar o mediar potentes trasformaciones, que cada vez tienen mayor aplicación en síntesis. Por ello, es frecuente que sean protagonistas de las etapas claves en la síntesis de moléculas complejas. algunos de los complejos metálicos se muestran en la siguiente figura. (Figura 2) figura 2 a.4) discusión de resultados. se comenzó con la obtención de los sustratos alquénicos 18a y b, fácilmente asequible por métodos descritos en la literatura [4,5] aunque la mayoría de los pasos fueron optimizados cambiando las condiciones de reacción, mejorando los rendimientos y usando p-metoxibencil (pmb) como grupo protector, tal como proponía la bibliografía para la síntesis de ono 1714[6a]. Tras la aminolisis de 33 y la formación de la imida 35 se llevó a cabo su reducción empleando dibal como agente reductor. La deshidratación de 36 se llevó acabo con cloruro de mesilo y trietilamina obteniendo la olefina deseada con muy buenos rendimientos. (Esquema 3) esquema 3 sobre 18a se ensayaron diferentes condiciones de ciclopropanación, con diferentes catalizadores quirales y no quirales de rodio y cobre, variando disolvente, temperatura, tiempo de adición y obteniéndose dos ciclopropanos diastereoméricos fácilmente separables por cromatografía en columna junto con producto de partida sin reaccionar y un porcentaje de producto de inserción 37a (tabla1). tabla1 no catalizador mol % cat. Disolvente tª (oc) tiempo de adición rendimiento (%) % dra 19a-trans:19-cis ee % 19a-transb 18a 19a-trans 19a-cis 37a rh2(oac)4 4 ch2cl2 r.T. 4h 25 45 5 5 90:10 – 2 cu(oac)2 4 ch2cl2 r.T. 4h 32 19 10 8 67:33 – 3 rh2(oac)4 1 ch2cl2 r.T. 2h 27 30 15 6 66:33 – 4 rh2(oac)4 8 ch2cl2 r.T. 4h 26 32 20 5 57:43 – 5 rh2(oac)4 4 ch2cl2 r.T. 8h 29 25 19 5 60:40 – 6 rh2(oac)4 4 pentano r.T. 4h 24 27 15 6 61:39 – 7 rh2(oac)4 4 ch2cl2 4h 29 35 11 8 71:29 – 8 cuotf:a 1:1 ch2cl2 r.T. 4h 20 59 6 6 82:18 40 9 cuotf:b 1:1 ch2cl2 r.T. 4h 28 52 4 7 87:13 75 10 cuota:c 1:1 ch2cl2 r.T. 4h 18 62 10 5 78:22 55 a % dr determinado sobre el espectro 1h-nmr de la mezcla del crudo de reacción. b % ee determinado en hplc con una columna quiral chiral-agp (100×4.0 mm), fase móvil: 9% 2-propanol/10 mm tampón fosfato ph= 7.0. en esta tabla se muestran todas las condiciones de ciclopropanación ensayadas, observando que de todas ellas, las mejores son aquellas en las que se emplea el ligando 26 (1 mol%), 2 equivalentes de diazoacetato de etilo, en diclorometano y adición de 4 horas. (Esquema 4) esquema 4 cuando se emplearon catalizadores quirales el rendimiento aumento aunque el exceso enantiomérico obtenido es sólo aceptable. la asignación de la estereoquímica relativa de los ciclopropanos se realizó mediante experimentos n.O.E.. (Figura 3). figura 3 el exceso enantiomérico obtenido en el caso de los catalizadores quirales, se determinó por hplc empleando una columna quiral (chiral-agp (100×4.0 mm) columna; 9% 2-propanol/10mm tampón sodio fosfato a ph 7.0; velocidad de inyección= 0.9 ml/min.) cabe destacar, que el catalizador con el que se conseguía mejor exceso enantiomérico 25, era el que tenía peor rendimiento de reacción. Y cuando se determinaba el exceso enantiomérico sobre el producto 37, obtenido con el catalizador 26, el exceso enantiomérico disminuía. una vez optimizada la reacción de ciclopropanación sobre el producto sin metilo 18a, se sometió al producto 18b el cual posee un metilo igual que nuestro prototipo ono a las condiciones de formación del anillo de ciclopropano. se obtuvieron los 4 diastereomeros (figura 4), siendo al igual que en el caso anterior el isómero trans el mayoritario. Se observa de nuevo la formación de un producto de inserción 37b pero esta vez en la posición 5, no hemos encontrado una explicación a este cambio en la regioquímica del producto de inserción puesto que en este caso la presencia del metilo debería favorecer el mismo resultado que en la ciclopropanación de 37a. figura 4 de nuevo se observó que el catalizador de cobre 26 era el que permitía obtener mejores rendimentos, y mejor diastereoselectividad. Se consigue un pequeño exceso enatiomérico gracias a una resolución cinética tabla 2 no catalizador mol % cat. Rendimiento (%) % dra % ee 11b-anti-transb 10b 11b mezcla 11b-anti-trans 11b-anti-cis 12b 11 rh2(oac)4 4 30 69 42 18 8 57:28:8:7 – 12 cu(oac)2 4 32 72 41 16 6 16:43:25:16 – 13 cuotf:b 1:1 30 41 50 10 2 86:14:0:0 18 14 cuotf:c 1:1 18 82 65 10 7 57:25:12:6 14 15 rh2[4s-meox]4 1:1 28 73 30 36 5 39:52:9:0 9 16 rh2[5s-mepy]4 1:1 31 66 32 29 5 49:35:13:3 18 de nuevo, la asignación de la estereoquímica relativa de los ciclopropanos se realizó mediante experimentos n.O.E. (Figura 5) figura 5 a partir del diasterómero 19a-trans se intentó poner a punto un método de desprotección del pmb pero fracasarón todos los intentos, pese a que en la bibliografía, ono-1714 se sintetiza con pmb como grupo protector. (Tabla 3) tabla 3 entrada % cys:trans ciclopropanación compuesto reactivo disolvente/tª rendimiento desprotección 17 78:22 19a-trans tfa, 48h 80ºc apertura del anillo+ producto final (5%) 18 19a-trans tfa, tioanisol r.T. Producto inicial 19 19a-trans h2, pd/c acoet/meoh, 50ºc producto inicial 20 19a-trans h2, pd/c, 40 psi, 94h acoet/meoh, 50ºc producto inicial 21 19a-trans alcl3 anisol, r.T. Producto inicial 22 19a-trans bf3.Oet2, 35h anisol, 100ºc descomposición 23 19a-trans can ch3cn/h2o (7/3) descomposición 24 19a-trans ddq ch2cl2/h2o — como consecuencia del bajo rendimiento obtenido en los diferentes ensayos de desprotección, se buscaron otros grupos protectores alternativos (esquema 5), cuyas desprotecciones se pusieron a punto.(Tabla 4) esquema 5 tabla 4 entrada % cys:trans ciclopropanación compuesto reactivo disolvente/tª rendimiento desprotección 25 74:26 38a can ch3cn/h2o (7/3) — 26 75:25 38b h2, pd/c, 35 psi acoh/etoh producto inicial 27 38b alcl3 benceno, r.T. Producto inicial 28 38b na/nh3 liq. Thf producto inicial 29 64:36 38c can ch3cn/h2o (7/3) — 30 62:38 38d tfa, 16h 75ºc 36% en vista de los resultados obtenidos, se optó por llevar a cabo la síntesis de las olefinas que estuvieran protegidas con dmb (2,4-dimetoxibencil), con el que se conseguía un rendimiento aceptable. esto obligó a llevar a cabo la síntesis de los productos olefínicos 46a y 38d, siguiendo la misma metodología que se aplicó para las olefinas anteriormente descritas.(Esquema 6) esquema 6 sobre 46a y 38d, se llevó a cabo la reacción de ciclopropanación, utilizando las mejores condiciones ensayadas anteriormente. (Esquema 7) esquema 7 también se observó, que al llevar a cabo la reacción de ciclopropanación se obtenían los productos 48 como producto de inserción, que se caracterizó por los métodos habituales de rmn. se observa un aumento de la diastereoselectividad, y no se observa exceso enantiomérico en el proceso. la asignación de la estereoquímica relativa de los ciclopropanos se realizó mediante experimentos n.O.E. (Figura 6) figura 6 el isómero 47b-anti-cis se obtuvo como mezcla con el isómero mayoritario, de modo que para poder separarlo de transformó el grupo amida en tioamida 65, que permitó obtener el isómero minoritario. (Esquema 8) esquema 8 para obtener los derivados deseados, se optimizó la desprotección del dmb, aumentando el rendimiento cuando la desprotección se realiza a partir de la tiomidas 49, y no de las amidas 47. (Esquema 9) esquema 9 finalmente se obtuvieron las amidinas 6 y 8 mediante tratamiento de las tioamidas 50 con metanol saturado de amoniaco con buen rendimiento. en todos los ensayos de actividad biológica se probaron los correspondientes clorhidratos.(Esquema 10) esquema 10 ¿ síntesis de derivados clorados. para la síntesis de los derivados clorados 13-17, se siguió la metodología descrita en la bibliografía pero utilizando el grupo 2,4-dimetoxibencil como grupo protector. la síntesis comenzó con la obtención del alqueno 38d, que se sometió a la una clásica reacción de ciclopropanación de adición de un carbeno a un doble enlace,[4] permitiendo obtener los productos 54 y 55, cuya asignación de su estereoquímica relativa se llevó a cabo mediante experimentos n.O.E. (Figura 7) figura 7 estos productos se transformaron en sus correspondientes amidinas mediante la metodología descrita anteriormente.(Esquema 11) esquema 11 para la obtención de los derivados monoclorados, se llevó a cabo la eliminación de un átomo de cloro, mediante el uso de trifenilestagnano en benceno.[4] (esquema 10).Permitiendo obtener los productos 56 y 57 como una mezcla inseparable de isómeros, que tras ser trasformados en tioamidas permitieron su separación cromatográfica. La asignación de la estereoquímica relativa de los ciclopropanos se realizó mediante experimentos n.O.E. (Figura 8) figura 8 las posteriores transformaciones del isómero mayoritario permitieron obtener el derivado 14, que se transformó en el correspondiente clorhidrato.(Esquema 12) esquema 12 ¿ síntesis de derivados enantioméricamente puros. para ello fue necesario obtener el sustrato olefínico enantioméricamente puro 65.[5] partiendo del ácido (3r)-5-metoxi-3-metil-5-oxopentanoico comercial 61, la síntesis de 62 se llevó a cabo mediante una reacción de reducción con excelente rendimiento. El producto 62 se transforma en la amida 63 mediante el uso de dmb (2,4-dimetoxibencilamina). La amida 63 se trata con sulfuro de piridina en dimetisulfóxido para llegar al alcohol 64 con bajo rendimiento. El sustrato olefínico 65 de consigue mediante la deshidratación del alcohol 64 con cloruro de mesilo en trietilamina con rendimiento moderado.(Esquema 13) esquema 13 para la síntesis del anillo de ciclopropano enantioméricamente puro, se emplearon las mejores condiciones de ciclopropanación ensayadas anteriormente. Obteniendo el producto 66 como único isómero, con muy bajo rendimiento (19%). Esto se puede justificar por resolución cinética de reacción.(Esquema 14) esquema 14 la asignación de la estereoquímica relativa del ciclopropano se realizó mediante experimentos n.O.E. (Figura 9) figura 9 para la síntesis de la amidina final 12 y su correspondiente clorhidrato (69) se siguió el procedimiento anteriormente descrito para los productos racémicos 6 y 8, si bien los rendimientos fueron algo más bajos.(Esquema 15) esquema 15 ¿ síntesis de derivado monoclorados y ono 1714. además se sintetizó ono 1714 como compuesto de referencia. Para ello nos hemos basado en lo publicado en la bibliografía pero optimizado en muchos pasos que nunca pudimos reproducir, entre ellos la desprotección del pmb. partiendo de la olefina 65, se siguió la misma metodología propuesta para los derivados racémicos 13 y 15,[4] permitiendo obtener el isómero mayoritario 16, que de nuevo se transformó en su correspondiente clorhidrato (74) con buen rendimiento. (Esquema 16) esquema 16 la asignación de la estereoquímica relativa de los ciclopropanos se realizó mediante experimentos n.O.E.. (Figura 10) figura 10 se obtuvieron el derivado monoclorado 17 y ono 1714, empleando la metodología descrita anteriormente, si bien los rendimientos fueron más bajos.(Esquema 17) esquema 17 para la separación de los isómeros 94 y 95 fue necesario su trasformación en sus respectivas tioamidas. (Esquema 18) esquema 18 la asignación de la estereoquímica relativa de los ciclopropanos se realizó mediante experimentos n.O.E. (Figura 11) figura 11 ¿ síntesis de derivados que portan en su estructura de ciclopropano un grupo cf3. a partir de la olefina 38d, y empleando las mejores condiciones de ciclopropanación ensayadas (tabla 2), se obtuvieron los ciclopropanos 78.(Esquema 19) esquema 19 el isómero 78b-anti-cis se obtuvo como mezcla con el isómero mayoritario, su transformación en tioamida 80, que permitió su separación.(Esquema 20) esquema 20 a partir del isómero mayoritario se llegó al derivado 10, utilizando la metodología descrita anteriormente.(Esquema 21) esquema 21 la asignación de la estereoquímica relativa del ciclopropano se realizó mediante experimentos n.O.E.(Figura 12) figura 12 a.5) ensayos de actividad biológica. el estudio se diseñó para evaluar los efectos in vitro de los compuestos sintetizados en las funciones de macrófagos obtenidos de peritoneo de ratón activados con lps e inf. así: ¿ la determinación de no se realizó de manera indirecta a través de la cuantificación de nitritos por la reacción colorimétrica de estos con el reactivo de griess. ¿ a continuación se realizó un ensayo colorimétrico que emplea la reacción de sulforodamina b (srb) para la medida cuantitativa del crecimiento y viabilidad celular ¿ por último se evaluó la actividad enzimática inhibitoria sobre inos recombinante de ratón a través del ensayo de 3h-citrulina. como línea celular se utilizó la -ct2a: es un astrocitoma de ratón transfectado con un plásmido con gfp (green fluorescent protein). Es una proteína propia de medusas con una fluorescencia intrínseca, muy intensa, debida a un fluoróforo generado por la oxidación de la secuencia ser-tyr-gly (ó thr-tyr-glu). ¿ cuantificación del no. al ser el no una molécula tan elusiva y que reacciona rápidamente con otros elementos, se prefiere su cuantificación indirecta, lo cual puede lograrse al medir sus metabolitos, como los nitritos. El nitrito, metabolito estable del no, se usó como indicador para determinar la producción de no. el acúmulo de nitrito liberado al medio de cultivo se determinó por colorimetría mediante la reacción de griess, en la cual estos metabolitos son transformados en compuestos diazo coloreados, constituye uno de los ensayos más utilizados con esta finalidad. durante esta reacción los nitritos son sometidos a reacción de diazotación con la sulfanilamida para formar una sal de diazonio de sulfanilamida, la cual puede acoplarse con la n-(1-naftil)etilendiamina, un compuesto con un espectro de absorción característico. (Figura 13) figura 13 el estudio de la liberación de no se ha realizado sobre macrófagos aislados de peritoneo de ratón. Para ello 1 x 106 macrófagos/ml se incuban en microplacas de 24 pocillos y fondo plano. A las 24 h de incubación se estimulan con interferón gamma (inf-) (50 u/ml) y lipopolisacáridos (lps) (100 ng/ml) en presencia y ausencia de inhibidor. A las 48h se recogieron 400 ml de medio de cultivo por pocillo (se conservaron a -20oc hasta su procesamiento). Una vez descongeladas las muestras se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos. Alícuotas de 100 ¿l de cada muestra se añadieron por triplicado en una placa de 96 pocillos. Paralelamente se preparó una curva patrón con nano2 (0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 mm) y alícuotas de 100ml de cada muestra patrón se añadieron por duplicado a la placa. Se procedió a la preparación del reactivo de griess, mezclando a partes iguales el reactivo reactivo de griess r1( 1 % de ácido sulfanílico en 5% de ácido fosfórico (10 mg de ácido sulfúrico/ml de ácido fosfórico)), y el reactivo de griess r2 (0,1% de nned: n-(1-naftil) etilendiamino dihidroclorido, (1 mg nned/ ml h2o)), y se añadieron 100ml a todos los pocillos. A continuación se cuantificó la absorbancia de las muestras a 540 nm de longitud de onda con un lector de placas (fluostar optima). en este gráfico se muestra el efecto de los compuestos 53a, 53b y ono1714 sobre la producción de nitrito en macrófagos primarios de peritoneo tras 48h de activación. Los datos se compararon con un control activado (+) y un control no activado (-) en ausencia de los compuestos 53. como se muestra en el siguiente gráfico, se observó para el compuesto de referencia ono-1714, una inhibición significativa, dependiente de la dosis, en la producción de no para los macrófagos tratados con lps + inf-. Tomando como referencia un control positivo sin inhibidor. para los compuestos 53 no se observó ninguna variación. figura 14 tras la determinación de nitritos se llevó a cabo un ensayo de viabilidad celular con el ensayo de la sulforodamina. ¿ test de la sulforodamina b (srb) el nci (instituto nacional del cáncer en eeuu) desarrolló un método de ensayo in vitro para compuestos antitumorales basándose en la tinción con sulforodamina b (srb). Este método mide el contenido proteico celular de cultivos adherentes o en suspensión en placas de 96 pocillos, según la técnica descrita por skehan y col. 1990[9]. El srb es un colorante aminoxanteno de color rosa, con dos grupos sulfónicos. Estos grupos sulfónicos se unen de forma electrostática con los residuos de los aminoácidos básicos de las proteínas en condiciones ligeramente ácidas[10] . La técnica de tinción de la sulforodamina b, permite estudiar la inhibición del crecimiento celular. La srb se une a las proteínas celulares, midiéndose espectrofotométricamente la densidad óptica a 540 nm, lo que nos proporciona información sobre el crecimiento celular relativo y la viabilidad de las células. se fijaron las células añadiendo 50 ¿l por pocillo de ácido tricloro acético (tca) al 12,5 % en agua bidestilada. Se incuba durante 1 hora a 4ºc y después se centrifuga a 1000 rpm durante 5 minutos a 4ºc. Tras esto, se elimina vigorosamente la solución de fijación y se lava con agua abundante. Se secan con aire frío. una vez fijadas las células, se tiñen con srb 0,4% (peso/volumen) en 1% de ácido acético (poniendo 80 ¿l por pocillo) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras este período el srb fue eliminado y los cultivos se lavaron (al menos dos veces) con ácido acético al 1% para eliminar los restos de colorante. Tras el secado óptimo el colorante unido a las proteínas fue solubilizado en tampón trizma base (poniendo 200 ¿l por pocillo) durante 30 minutos a temperatura ambiente, en agitación. A continuación, se procedió a la lectura de las densidades ópticas, mediante un lector de placas a 540 nm. no se observó citotoxicidad a las concentraciones ensayadas. ¿ determinación de la actividad inhibitoria de inos por último se evaluó la actividad enzimática inhibitoria sobre inos recombinante de ratón a través del ensayo de 3h-citrulina. estructura compuesto inos (ci50 ¿m) 53a > 100 53b > 100 ono-1714 0,011 finalmente, se examinó la actividad inhibitoria de compuestos 53a y 53b frente la inos usando el ensayo de 3h-citrullina. Los compuestos 53a y 53b no inhibían la actividad del inos (ic50>100 m). se observa una ic50 para ono 1714 del orden nanomolar, datos comparables a los descritos en la bibliografía.[6a] b) organocatálisis: reacción de ciclopropanación vía iluros de amonio. b.1) introducción. el término organocatálisis se refiere a una forma de catálisis donde la velocidad de la reacción aumenta por el empleo de un catalizador orgánico que consiste en un compuesto orgánico que contiene c, h, s y cualquier otro elemento no metálico. el término organocatálisis no es más que un nuevo nombre para una antigua metodología pero que ha experimentado un notable impulso en los últimos años. Esto queda abalado por el enorme número de publicaciones desde el año 2000 y que dan una buena cuenta de la magnitud de esta área emergente.(Figura 24) figura 15 nº de publicaciones con el término organocatálisis en el título o en el abstract desde el año 2000 (fuente scifinder: noviembre de 2000) el interés actual de la organocatálisis se centra sobre todo en el uso de catalizadores quirales para dar nombre a lo que se conoce como organocatálisis asimétrica. b.2) objetivos. la síntesis de anillos de ciclopropanos es un rasgo común en la síntesis de moléculas complejas y en química medica, esto se debe a la combinación de su reactividad y sus propiedades estructurales.[11 a-c] estas propiedades han hecho de la preparación de ciclopropanos un blanco atractivo a la para el desarrollo de una nueva la metodología sintética. a pesar de existir direfentes procesos para la síntesis de ciclopropanos funcionalizados, existen actualmente, pocos métodos sintéticos con catalizadores enantioselectivos.[12 a-e] de los métodos disponibles, las reacciones mediadas por carbenoides [2c-e] son las más utilizadas (esquema 22) esquema 22 sin embargo, también existen ejemplos de ciclopropanaciones enantioselectivas mediadas por iluros.[12 a,b,e] recientemente, se ha descrito un proceso del ciclopropanacion a través de iluros de amonio, utilizando cantidades estequiometricas de una anina nucleófila terciaria. [13] estos procesos producen un amplio rango de moléculas del funcionalizadas con una diastereo y enantioselectividad excelente.(Esquema 23) esquema 23 estas cilopropanaciones enantioselectivas vía ilusos de amonio[14] presentan varias ventajas. No existe ningún metal de la transición involucrado en la reacción, y los materiales de partida son fácilmente asequibles.[15] además, el gran número de aminas con centros quirales conocidas permiten seleccionar catlizadores quirales potenciales. en esta aproximación una alfa-halocetona con un electrón desapareado reacciona con un alqueno deficiente en electrones a través de la formación de un iluro de amonio, para generar una nueva estructura bicílica (esquema 24). Esta estrategia organocatalítica evita el uso de diazocompuestos muy sensibles. esquema 24 el ciclo catalítico propuesto se muestra en el siguiente esquema.(Esquema 25) esquema 25 en este esquema, el compuesto alfa bromocetona 1 sufre un desplazamiento sn2 con la amina terciaria (catalizador) y forma una sal del amonio cuaternaria i. Su desprotonación con la base forma el iluro del amonio ii y a través de una reacción intramolecular conjugada forma iii, para dar finalmente el bicicloalcano 2, que se genera a través del desplazamiento del grupo del amonio, mientras que el catalizador es regenerando. el objetivo planteado en la presente memoria es profundizar en la síntesis de nuevos compuestos bicíclicos [n.1.0], que contengan en su estructura un anillo de cilopropano. Síntesis que tendrán como paso clave la organocatálisis asimétrica mediada por iluros de amonio. para ello se utilizarán tanto catalizadores quirales como no quirales.(Figura 16) figura 16 ¿ síntesis con catalizadores no quirales. se comenzó con la obtención de la olefina 93, fácilmente asequible por métodos descritos en la literatura[16,17], aunque la mayoría de los pasos fueron optimizados. Tras la formación de la amida 91, se llevó a cabo la introducción del grupo fenilselenil en la posisión 3, utilizando lihmds como base y cloruro de fenilselenio como electrófilo, permitiendo obtener el producto 92 con buenos rendimientos. Finalmente, la eliminación del grupo fenilselenil con amcpb como agente oxidante a 0ºc, condujo a la obtención del nsaturado 93 con buen rendimento.(Esquema 26) esquema 26 sobre el producto 93 se ensayaron diferentes condiciones de ciclopropanación, con diferentes catalizadores no quirales, variando disolvente, temperatura, y bases, obteniéndose el producto ciclopropánico 94, junto con producto de partida sin reaccionar y un porcentaje de producto dimérico 37a (tabla 5). no catalizador 1eq. Base 1.2eq. Disolvente tiempo/ tªc halocetona 1 eq. Aditivo 40%mol rendimiento% pp dimero 94 31 dabco csco3 dce 24h/80º 95 33 32 dabco csco3 acn 24h/80º 95 3 33 dabco csco3 dce 12h/80º 95 50 34 dabco na2co3 acn 24h/80º 95 0 35 dabco csco3 acn 12h/80º 95 nai 60 36 dbu csco3 acn 12h/80º 95 nai 0 37 dbu csco3 acn 12h/80º 95 0 tabla 5 en esta tabla se muestran todas las condiciones de ciclopropanación ensayadas, observando que de todas ellas, las mejores son aquellas en las que se emplea el catalizador dabco, csco3 como base, 1 equivalente de fenilbromocetona 95, en acetonitrilo y adición de 12 horas de reacción. (Esquema 27) esquema 27 una vez optimizada la reacción de organocatálisis sobre el producto 93, se ensayaron diferentes bromocetonas. (Figura 17) figura 17 en la siguiente tabla se recogen los resultados obtenidos.(Tabla 6) no catalizador 1 eq. Base 1.2 eq. Disolvente (0.25m) halocetona 1 eq. Aditivo 40%mol tiempo/ tªc rendimiento% pp dimero pf 38 dabco csco3 acn 100 — 12h/80º 50 0 39 dabco csco3 acn 100 nai 12h/80º 50 0 40 dabco csco3 acn 97 —– 12h/80º 25 35 30 41 dbu naco3 acn 97 —– 12h/80º 15 65 0 42 dbu csco3 acn 97 nai 12h/80º 100 0 0 43 dabco csco3 acn 98 —- 12h/80º 45 46 0 44 dabco csco3 acn 99 12h/80º 50 49 0 45 dabco csco3 acn 101 —- 12h/80º 55 45 0 46 dabco csco3 acn 101 nai 12h/80º 65 34 0 47 dabco naoh acn 101 12h/80º 35 65 0 tabla 6 se obtuvieron los siguientes ciclopropanos, cuya asignación de la estereoquímica relativa del ciclopropano se realizó mediante experimentos n.O.E.(Figura 18) figura 18 se observa que cuando no se producía reacción de ciclopropanación, el producto de partida reaccionaba intermolecularmente, dando lugar sólo a la formación del producto dimérico 96, que se caracterizó por los métodos habituales de rmn, y cuyo rendimiento aumentaba cuando la base que se utilizaba era más fuerte.(Figura 19) figura 19 a la vista de los resultados, nos propusimos la síntesis de un nuevo sustrato alquénico, que nos permitiera obtener diferentes funcionalizaciones del cilopropano, y disminuyese la formación del producto dimérico, para lo cual elegimos como grupo protector el tosilo, que además nos permitía una mayor

Datos académicos de la tesis doctoral «Síntesis y evaluación biológica de nuevos sistemas bicíclicos [4.1.0] obtenidos mediante reacciones de ciclopropanación estereoselectivas«

• Título de la tesis:  Síntesis y evaluación biológica de nuevos sistemas bicíclicos [4.1.0] obtenidos mediante reacciones de ciclopropanación estereoselectivas
• Autor:  Irene Suárez Del Villar Carrero
• Universidad:  San pablo-ceu
• Fecha de lectura de la tesis:  24/02/2010

Dirección y tribunal

• Director de la tesis
  • Javier Perez Castells
• Tribunal
  • Presidente del tribunal: Juan josé Vaquero lópez
  • carmen Del campo perez (vocal)
  • ricardo Martínez murillo (vocal)
  • pedro Antonio Aleman lopez (vocal)